依达拉奉对大鼠脑梗死急性期神经功能的影响

2020-05-26 06:08
中西医结合心脑血管病杂志 2020年8期
关键词:达拉造模急性期

脑梗死是目前全球范围内的常见病、多发病,具有高发病率、高致死率、高致残率特点,严重影响病人生活质量,占全部脑卒中的60%~80%[1-2]。近年来脑梗死急性期的治疗有一定进展,然而神经元结构错综复杂,导致脑功能恢复困难重重[3]。目前临床治疗且具有循证医学证据的清除自由基药物包括依达拉奉,其是治疗急性脑梗死的常用药,通过抗氧化和清除自由基,抑制神经元氧化损伤,具有抗凋亡和神经保护作用[4]。本研究探讨依达拉奉对大鼠脑梗死急性期神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠购于维通利华实验动物有限公司,体重250~300 g,饲养于首都医科大学动物房,所有造模及取材流程符合首都医科大学动物伦理委员会要求。

1.1.2 实验药物 依达拉奉购自昆明积大制药股份有限公司,产品批号170507,大鼠给药剂量为10 mg/kg。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 根据Longa等[5]报道建立大鼠永久性脑缺血模型(MACO)的方法。采用10%水合氯醛麻醉后,仰卧位固定于鼠板上。颈部正中纵行切开,暴露左侧颈动脉三角,逐层分离组织,剥离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),使用眼科剪在颈内动脉剪一楔形切口,插入头部圆球形鱼线,插入深度16~18 mm,阻断左侧大脑中动脉血流供应。假手术组仅分离颈总动脉,不插入鱼线。

1.2.2 Bederson神经功能评分 采用Bederson法[6]评估脑梗死后大鼠神经功能,评分方法见表1。总分为10分,评分越高提示神经功能缺损越重。造模后随即进行评分,此后第1天、第3天、第7天相同时间分别再次进行评分。

表1 Bederson评分表 单位:分

1.2.3 分组及给药 SD大鼠分为假手术组(6只)、模型组与依达拉奉组各18只,每个时间各6只,其中3只用于免疫组化,3只用于蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链式反应。SD大鼠造模成功后随机分为模型组与依达拉奉组,假手术组大鼠仅分离颈总动脉,不进行结扎。造模后立即给药,腹腔注射依达拉奉注射液,剂量为10 mg/kg。

1.2.4 取材及指标检测 造模后第1天、第3天、第7天麻醉大鼠,断头取脑,剥离缺血脑半球,制备组织匀浆,提取蛋白及总RNA。分别进行蛋白免疫印迹(Western Blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测,选取GAPDH为内参,引物序列见表2,每组至少3个样本。

表2 qPCR所用的引物序列

2 结 果

2.1 依达拉奉对大鼠脑梗死急性期神经功能评分的影响 采用Bederson神经功能评分量表评估MCAO大鼠脑梗死急性期神经功能变化,结果发现脑梗死后3 d内依达拉奉组与模型组Bederson神经功能评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);第5天及第7天依达拉奉组Bederson神经功能评分均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

与模型组比较,*P<0.05。

2.2 依达拉奉对MCAO大鼠海马区神经元数量的影响 造模成功后第1天、第3天、第7天取患侧半球脑组织,石蜡包埋后切片,采用免疫组化方法,以NeuN标记神经元,选取代表性图片进行统计学分析,见图2A。结果发现模型组海马区神经元明显减少,依达拉奉组第3天、第7天神经元数量明显多于模型组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),详见图2B。

a:假手术组;b:模型组第1天;c:模型组第3天;d:模型组第7天;e:依达拉奉组第1天;f:依达拉奉组第3天;g:依达拉奉组第7天。与模型组同时间比较,*P<0.05,#P<0.01。

(A:各组不同时间石蜡切片图;B:各组海马区神经元IOD比较)

2.3 依达拉奉对MCAO大鼠脑梗死急性期缺血脑半球Bcl-2及Bax蛋白含量的影响 Western Blot结果见图3。第7天,脑梗死后大鼠脑组织Bcl-2蛋白含量较假手术组降低,依达拉奉组较模型组Bcl-2蛋白含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组Bax蛋白含量升高;与模型组比较,依达拉奉组不同时间Bax蛋白含量差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表3。

a:假手术组;b:模型组第1天;c:模型组第3天;d:模型组第7天;e:依达拉奉组第1天;f:依达拉奉组第3天;g:依达拉奉组第7天。

项目组别只数第1天第3天第7天Bcl-2蛋白假手术组 31.07±0.060.95±0.081.13±0.10模型组 30.76±0.070.66±0.120.43±0.10依达拉奉组30.85±0.050.71±0.040.58±0.04①Bax蛋白假手术组 30.96±0.120.91±0.111.03±0.09模型组 31.62±0.111.90±0.122.24±0.14依达拉奉组31.06±0.13②1.48±0.08②1.76±0.15①

与模型组同时间比较,①P<0.05,②P<0.01。

2.4 依达拉奉对MCAO大鼠脑梗死急性期缺血半球Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表达的影响 第1天、第3天,脑梗死后Bcl-2 mRNA表达无明显变化,第7天升高;依达拉奉组各个时间Bcl-2 mRNA表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。脑梗死后Bax mRNA表达升高,依达拉奉可抑制Bax mRNA上升趋势;与假手术组比较,依达拉奉组第1天和第7天Bax mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

项目组别只数第1天第3天第7天Bcl-2 mRNA假手术组 31.03±0.141.14±0.211.16±0.19模型组 30.99±0.141.10±0.161.73±0.43依达拉奉组31.87±0.24②2.14±0.22②3.08±0.55①Bax mRNA假手术组 30.46±0.050.55±0.080.45±0.07模型组 31.06±0.251.47±0.141.81±0.36依达拉奉组30.63±0.10①1.10±0.190.93±0.10①

与模型组同时间比较,①P<0.05,②P<0.01。

2.5 依达拉奉对MCAO大鼠脑梗死急性期缺血半球VEGF蛋白含量及mRNA表达的影响 Western Blot结果见图4。第3天及第7天,依达拉奉组可阻滞大鼠脑梗死急性期VEGF水平进行性下降的病理过程,VEGF mRNA表达高于模型组,详见表5、表6。可见依达拉奉转录及翻译水平抑制脑梗死造成VEGF降低,促进新生血管生成,从而起到保护神经元作用。

a:假手术组;b:模型组第1天;c:模型组第3天;d:模型组第7天;e:依达拉奉组第1天;f:依达拉奉组第3天;g:依达拉奉组第7天。

组别 只数第1天第3天第7天假手术组 31.01±0.050.98±0.071.07±0.04模型组 30.65±0.070.50±0.030.34±0.03依达拉奉组30.70±0.090.65±0.07①0.57±0.03②

与模型组同时间比较,①P<0.05,②P<0.01。

组别 只数第1天第3天第7天假手术组 30.35±0.020.37±0.040.34±0.07模型组 30.28±0.020.28±0.010.27±0.06依达拉奉组30.31±0.030.37±0.05①0.37±0.02①

与模型组同时间比较,①P<0.05。

3 讨 论

脑细胞凋亡是脑梗死后细胞发生的重要病理过程,其受到多种基因及蛋白调节。Bcl-2家族是其中重要的一环[7]。Bcl-2家族包含多种进化相对保守的蛋白,共同特征是具有Bcl-2同源域。通过调控线粒体外膜通透性调控凋亡。Bcl-2家族分为两类,一类抑制凋亡,一类促进凋亡[8]。其中抑制凋亡的以Bcl-2为代表,促进凋亡的以Bax为代表。细胞凋亡程度由二者表达水平高低和比例决定[9-10]。

本研究结果显示,依达拉奉能改善MCAO大鼠脑梗死急性期神经功能,与模型组比较,第7天,依达拉奉组梗死脑半球内Bcl-2含量均高于模型组,Bax含量各个时间均低于模型组;依达拉奉组Bcl-2 mRNA各个时间均高于模型组,第1天和第7天Bax mRNA均低于模型组。结果与Western Blot相符。由此推测,脑梗死急性期依达拉奉通过调节Bcl-2和Bax水平抑制细胞凋亡,从而改善大鼠神经功能。

VEGF是一种由细胞分泌的信号蛋白,主要作用是促进新生血管生成,对胚胎血管发育及后天新生血管至关重要[11]。在血供不足、组织缺氧情况下,VEGF帮助新生血管生成,重新恢复血液及氧气供应[12]。近年来,VEGF在脑梗死后发挥的作用引起广泛重视,越来越多研究证实提高VEGF含量对脑梗死病人神经功能恢复及预后至关重要[13-14]。提高VEGF表达的相关机制得到深入研究[15-16]。本研究结果发现,依达拉奉能提高大鼠脑梗死后缺血半球内VEGF含量,梗死后第3天及第7天依达拉奉组VEGF水平均优于模型组。因此,依达拉奉可促进缺血半球新生血管生成,恢复血供,从而减少神经元死亡,促进神经功能。

依达拉奉是一种临床常用的治疗脑梗死药物,具有清除自由基作用,本研究发现依达拉奉能在脑梗死急性期可抑制凋亡、促进血管再生,从多种机制提高神经功能。然而脑梗死后产生的多种自由基与凋亡、血管再生关系仍不明确,需进一步深入研究。

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