血清miR-223、CXCR4与冠状动脉支架内再狭窄的关系探讨

随着医疗技术快速发展，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)已成为冠心病治疗的重要手段，临床应用率达90%以上，显著降低冠心病血管事件的发生率和死亡率[1]。血管管腔内介入治疗创伤小，已成为冠心病病人首选的治疗术式，同时支架植入后并发症逐渐受到临床关注。约10%的病人PCI术后数月内发生支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)，是PCI术疗效不佳的主要原因，严重影响病人的生存质量和预后[2]。引起PCI术后ISR的发生与多个因素有关[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)在肿瘤增殖、免疫调控、炎症反应和血管内膜再生等方面发挥重要作用[4]。miRNA功能复杂，目前研究尚不深入。趋化因子是一类能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。CXC族趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)属于CXC类趋化因子受体，是趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-drived factor-1，SDF-1)受体，二者共同影响细胞迁移、组织的靶向作用[5]，但miR-223和CXCR4的表达与冠状动脉支架内再狭窄的关系尚不清楚。本研究拟通过检测血清miR-233、CXCR4在有无再狭窄冠心病病人中的表达情况，旨在探讨二者与PCI术后冠状动脉支架内再狭窄发生的关系。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

1.1.1 纳入标准 符合2012年美国心脏学会制定的冠心病诊断标准[6]，并经冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄75%以上，进行支架植入手术；病人和家属知情并自愿签署知情同意书；病人依从性好，能配合完成治疗和后期随访。

1.1.2 排除标准 心力衰竭及重度贫血病人；恶性肿瘤病人；血液系统、肝胆疾病、肾功能不全和急性感染病人；合并其他心脏疾病，如风湿性心脏病等。

1.2 临床资料 选取2015年3月—2017年5月我院收治的冠心病病人210例为研究对象，择期进行冠状动脉造影检查证实右冠状动脉、左前降支和左回旋支中至少一支狭窄75%以上，适时进行支架植入手术治疗。术后给予常规药物治疗。术后12个月内复查冠状动脉造影，根据造影结果分为无再狭窄组(186例)和ISR组(24例)。无再狭窄组，男92例，女94例，年龄(68.95±12.42)岁；ISR组，男13例，女11例，年龄(70.13±18.64)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料收集 分别收集两组性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)、吸烟史，是否患有高血糖及药物治疗情况，是否患有高血压性心脏病及药物治疗情况。松下EW-BU08J测量两组收缩压和舒张压，抽取清晨空腹静脉血，使用普朗XFA6100全自动血液细胞分析仪，检测血液总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

1.3.2 冠状动脉造影 采用德国西门子数字血管造影机(Axiom Artis FA)引导病人选取最佳体位，按照常规标准技术进行造影，选择左冠状动脉、右冠状动脉左主干回旋支和左前降支，确定冠心病狭窄度及植入支架内是否存在再狭窄。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测血清miR-223和CXCR4表达水平 两组均在冠状动脉造影前抽取静脉血5 mL于抗凝管，离心后取血清备用。以德国QiaGen总RNA试剂盒提取血清总RNA，按说明书进行操作。分别采用TaKaRa生产的miRNA反转录试剂盒和qRT-PCR反转录试剂盒，按照操作说明将2 μg无杂质完整RNA反转录为cDNA。按照TaKaRa公司SYBR Green PCR master mix试剂说明加配反应体系。qRT-PCR反应总体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，放入Bio-Rad荧光定量PCR仪进行反应，程序设定为：95 ℃预变性30 s，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，共40个循环，72 ℃终延伸10 min。其中miR-223以U6为内参基因，CXCR4以GAPDH为内参基因，引物见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt计算miR-223和CXCR4相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 两组临床资料比较(见表2)

表2 两组临床资料比较

2.2 两组血清miR-223和CXCR4表达水平比较 ISR组血清miR-223和CXCR4表达水平均高于无再狭窄组(P<0.05)。详见表3。

2.3 miR-223和CXCR4水平与ISR病人临床病理特征的关系 血清miR-223和CXCR4表达与ISR病人病变部位关系不明显(P>0.05)；血清miR-223和CXCR4表达与ISR病人病变类型和长度有关(P<0.05)。详见表4。

组别例数miR-223/U6CXCR4/GAPDH无再狭窄组1861.02±0.181.15±0.51ISR组242.87±0.723.87±0.69 t值-29.062-23.533 P 0.000 0.000

表4 ISR病人血清miR-223和CXCR4水平与临床病理特征的关系

2.4 血清miR-223、CXCR4表达与ISR发生因素的相关性分析 Pearson相关性分析结果表明，血清miR-223、CXCR4水平与ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相关(P<0.05)；与ISR病人血清TG、HDL-C和HbA1c水平相关性不明显。详见表5。

2.5 影响冠状动脉ISR发生的危险因素分析 Logistic分析结果显示，血清miR-223、CXCR4、TC、LDL-C水平及高血压、高血糖为冠状动脉ISR发生的危险因素。详见表6。

表6 影响冠状动脉ISR发生的危险因素分析

3 讨 论

冠心病是全球范围内发病率和死亡率较高的心血管疾病之一，且呈增长趋势[7]。PCI是临床治疗冠心病的主要手段，随着接受PCI治疗的冠心病病人逐年增加，支架植入后并发症逐渐引起研究者广泛关注。ISR定义为冠状动脉造影发现支架内全程及支架近端、远端5 mm范围内管腔狭窄程度50%，是PCI术后诸多并发症中常见的一种，严重影响手术治疗效果和病人生存质量[8]。ISR发生的实质是血管对损伤的一种病理反应。与冠状动脉粥样硬化慢性进展不同，PCI是相对较短时间内发生复杂炎症和修复过程，血管修复反应过度导致再狭窄。血管弹性收缩和血栓形成在冠状动脉支架植入后数分钟至数小时内完成，各种凝血因子及炎症因子刺激平滑肌细胞增殖和细胞外基质形成，一般术后数月或数周内进行，平滑肌细胞增殖导致新生内膜增生是ISR发生的主要病理机制[9]。

冠状动脉支ISR是一系列复杂的调控过程，受诸多因素影响。有研究表明，男性较女性更易发生ISR，高血糖和高血压是影响ISR的常见原因，TC和LDL-C是冠心病的独立影响因素并得到广泛的重视[10]。本研究结果显示，性别对冠状动脉造影病人ISR的发生无明显影响，可能是由于本研究样本量有限造成；本研究结果发现，ISR组血压、血糖、血清TC和LDL-C水平高于无再狭窄组，表明血压、血糖和血脂影响ISR的发生，与李朝晖等[10]研究结果一致，进一步证实血糖、血压和血脂影响冠状动脉ISR的发生。

血管新生内膜增生是影响ISR发生的重要因素，趋化因子在血管内膜生成过程起关键作用。趋化因子是一类可驱使细胞定向迁移的细胞因子。根据氨基酸序列将其分为CXC类、CC类、CX3C类和C类4个亚类。SDF-1是CXC趋化因子家族成员，主要作用是驱使中性粒细胞、造血干细胞、内皮祖细胞和心肌干细胞等迁移，参与炎症反应、血管新生、组织发育、肿瘤发生等生物过程[11]。CXCR4是SDF-1的特异受体，在造血功能、胚胎发育、肿瘤迁移中发挥重要作用[12]。本研究结果发现，ISR组血清CXCR4高表达病人ISR发生率高于低表达病人，推测CXCR4高表达可能通过参与新生内膜增生，影响冠心病病人PCI术后ISR发生。Shin等[13]研究表明缺血脑组织通过miR-223途径，调控SDF-1和CXCR4表达，推测ISR病人血清CXCR4表达上调可能与miR-223调控有关。miRNA是一类小片段非编码区RNA，主要通过特异结合靶基因3′-UTR，调控靶基因表达[14]。miRNA参与调控细胞生长、增殖、分化、炎症和免疫反应等生命活动[15]。王芳等[16]研究发现miR-663、miR-126和miR-370在新生内膜增生相对表达发生差异性变化。有研究表明，miR-223在胃癌治疗中发挥重要作用[17]，miR-223与ISR相关研究未见报道。本研究结果表明，ISR组血清miR-223水平高于无再狭窄组，表明miR-223表达水平升高可能与冠状动脉ISR的发生有关。Pearson相关性分析表明，ISR的发生与血清miR-223水平、血清CXCR4水平呈相关。Shin等[13]在缺血脑组织研究表明miR-223调控SDF-1表达，SDF-1激活CXCR4受体表达。本研究推测ISR发生过程可能存在类似调

控机制，即miR-223高表达调控SDF-1，激活CXCR4高表达，促进冠心病病人PCI术后内膜增生反应。相关性分析结果表明，血清miR-223和CXCR4水平与ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相关。Logistic分析表明血清miR-223、CXCR4、高血糖、高血压、TC和LDL-C水平为冠状动脉ISR发生的危险因素，与以往研究结果[18]一致。推测miR-223可能通过调控SDF-1表达，激活CXCR4受体表达，影响冠心病病人PCI术后ISR的发生。

综上所述，ISR病人血清miR-223和CXCR4表达水平增高，是影响ISR发生的危险因素，推测miR-223和CXCR4高表达与ISR的发生机制有关，本研究结果可为临床预测ISR发生提供参考。