急性一氧化碳中毒患者血清半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3水平变化及其与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关系研究

刘莹莹，刘赟，马利，屈永才

急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACMP）是目前临床上常见的中毒原因之一，CO与血红蛋白的亲和力远高于O2，因此吸入大量CO可造成人体多系统、多器官组织缺血缺氧性损伤，其中脑组织对缺血缺氧的耐受力差，因此ACMP可快速造成不同程度脑损伤。急性一氧化碳中毒后迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）指ACMP患者经过“假性治愈期”后再次出现以急性痴呆为主要临床表现的神经精神症状。研究表明，ACMP后脑组织损伤及DEACMP与细胞凋亡密切相关［1-3］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是调控细胞凋亡的重要因子之一。动物实验表明，ACMP模型大鼠脑组织caspase-3表达水平明显增加［4］；另有研究表明，缺血缺氧性脑病患儿血清caspase-3水平明显升高，且血清caspase-3水平与病情严重程度密切相关［5］。基于现有的研究证据，本研究旨在观察血清caspase-3在ACMP患者中的表达及意义，并探讨其与DEACMP的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 DEACMP诊断标准 ACMP患者经“假性治愈期”后突然起病，表现为意识障碍、精神行为异常、锥体系及锥体外系功能障碍等症状［6］。

1.2 一般资料 选取2015年1月—2018年3月延安大学附属医院收治的119例ACMP患者作为ACMP组，均符合《现代职业病诊疗手册》［7］中的ACMP诊断标准。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）中毒至入院时间≤48 h。排除标准：（1）住院期间死亡者；（2）合并严重肝肾功能不全、恶性肿瘤者；（3）合并乙醇依赖症等精神疾病者；（4）近3个月内出现过敏或接受激素、免疫抑制剂治疗者；（5）妊娠期女性。ACMP组患者中男54例，女65例；年龄28～73岁，平均年龄（48.0±12.6）岁。选取同期体检健康志愿者50例作为对照组，其中男25例，女25例；年龄30～68岁，平均年龄（47.6±13.0）岁。另根据随访90 d DEACMP发生情况将ACMP组患者分为DEACMP亚组31例和痊愈亚组88例。ACMP组和对照组受试者性别（χ2=0.302）、年龄（t=0.177）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经延安大学附属医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者对本研究知情并签署知情同意书。

1.3 血清caspase-3水平检测 ACMP患者、对照组分别于入院次日清晨和体检当日清晨采集空腹外周静脉血3 ml，3 000 r/min离心5 min（离心半径4.0 cm），留取上清液并置于-80 ℃冰箱中保存待测；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测受试者血清caspase-3水平，具体操作严格按照试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）说明书进行。

1.4 观察指标 （1）比较ACMP组、对照组受试者血清caspase-3水平。（2）采用格拉斯哥昏迷量表（Glasgow Coma Scale，GCS）评价ACMP患者病情严重程度。（3）比较DEACMP亚组、痊愈亚组患者临床资料，包括性别、年龄、体质指数（BMI）、昏迷时间、接触CO时间、高压氧治疗时间、入院时GCS评分、合并症（包括高血压、糖尿病、颅内疾病）、实验室检查指标〔包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、caspase-3〕。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料分析采用χ2检验；血清caspase-3水平与ACMP患者GCS评分间的相关性分析采用Pearson相关分析；DEACMP影响因素分析采用多因素Logistic回归分析；绘制ROC曲线以评价血清caspase-3水平对DEACMP患者的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACMP组和对照组血清caspase-3水平比较 ACMP组患者血清caspase-3水平为（27.5±5.6）ng/L，高于对照组的（16.1±4.8）ng/L，差异有统计学意义（t=12.568，P＜0.01）。

2.2 ACMP组患者血清caspase-3水平与入院时GCS评分相关性分析 ACMP组患者入院时GCS评分为（9.6±1.5）分；Pearson相关分析结果显示，ACMP患者血清caspase-3水平与入院时GCS评分呈负相关（r=-0.360，P＜0.01）。

2.3 DEACMP亚组与痊愈亚组患者临床资料比较 DEACMP亚组患者年龄大于痊愈亚组，昏迷时间、接触CO时间长于痊愈亚组，入院时GCS评分低于痊愈亚组，颅内疾病发生率、血清caspase-3水平高于痊愈亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组患者男性比例、BMI、高压氧治疗时间、高血压发生率、糖尿病发生率及ALT、AST、BUN、CK、CK-MB比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.4 多因素Logistic回归分析 将表1中有统计学差异的指标为自变量，DEACMP为因变量（变量赋值见表2）行多因素Logistic回归分析，结果显示，接触CO时间、入院时GCS评分及血清caspase-3水平是DEACMP的独立影响因素（P＜0.01，见表3）。

表1 DEACMP亚组与痊愈亚组患者临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data between DEACMP subgroup and recovery subgroup

表2 DEACMP影响因素的变量赋值Table 2 Variable assignment of influencing factors of DEACMP

表3 DEACMP影响因素的多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of DEACMP

2.5 ROC曲线 ROC曲线显示，血清caspase-3水平预测DEACMP患者的曲线下面积（AUC）为0.761〔95%CI（0.657，0.865）〕，最佳截断值为30.0 ng/L，灵敏度、特异度分别为77.4%、72.7%，见图1。

3 讨论

大量动物实验结果已经证实细胞凋亡参与DEACMP的发生、发展，MICHIUE等［8］研究表明，ACMP死亡患者的脑组织皮质、海马和基底核区均存在细胞凋亡现象。Caspase家族是一组存在于细胞质中结构高度类似的蛋白酶，主要参与真核生物细胞凋亡的调节，而caspase-3是最终发挥生物效应的蛋白酶，其是细胞凋亡级联反应的核心，因此caspase-3水平可一定程度反映机体细胞凋亡程度［4，9］。周准等［10］研究表明，ACMP大鼠模型脑组织细胞caspase-3水平较正常脑组织细胞明显增加；TOFIGHI等［11］在细胞体外培养中发现，及早caspase-3抑制剂可明显减少因接触CO而导致的凋亡细胞数目，可见caspase-3可能参与ACMP后脑损伤过程。目前，ACMP动物模型或患者血清caspase-3水平变化情况鲜有报道。宋诩等［5］研究表明，新生儿缺血缺氧性脑病患儿血清caspase-3水平明显升高，且血清caspase-3水平与病情严重程度密切相关，因此笔者推测ACMP患者血清caspase-3水平可能存在相似结果。本研究结果显示，ACMP患者血清caspase-3水平高于对照组，且血清caspase-3水平与ACMP患者入院时GCS评分呈负相关，完全支持本课题组的前期推测，究其原因为大量CO与血红蛋白结合而导致组织缺血缺氧，进而造成细胞凋亡所致。

图1 血清caspase-3水平预测DEACMP患者的ROC曲线Figure 1 ROC curve for serum caspase-3 level in predicting DEACMP patients

研究表明，轻度ACEM患者DEACMP发生率为10%～30%，重度ACMP患者其发生率高达50%以上［6］。ACMP患者“假性治愈期”时间长短不一，且缺少准确、可靠的预测指标，进而导致临床针对DEACMP的防治无从下手。因此，寻找DEACMP早期预测指标是目前ACMP研究的热点，而深入探讨DEACMP具体发病机制是该疾病未来预防和治疗的关键。近年多项动物实验结果显示，DEACMP模型脑组织Bax、Bcl-2、Bad、Fas、FasL等凋亡因子表达明显升高［1-3，12-13］。本研究结果显示，DEACMP亚组患者血清caspase-3水平高于痊愈亚组，且血清caspase-3水平是DEACMP的独立影响因素，进一步证实细胞凋亡在DEACMP发病中具有关键作用。另外，本研究结果显示，接触CO时间、入院时GCS评分亦是DEACMP的独立影响因素。既往研究表明，年龄、中毒时间、昏迷时间、吸入CO浓度及早期高压氧治疗时间是DEACMP的独立影响因素［14］，本研究结果与之相似。本研究结果还显示，血清caspase-3水平预测ACMP患者DEACMP的AUC为0.761〔95%CI（0.657，0.865）〕，提示血清caspase-3水平对DEACMP患者具有一定的预测价值，但在临床工作中仍需参考包括接触CO时间及入院时GCS评分在内的其他指标以提高预测准确性。

综上所述，ACMP患者血清caspase-3水平明显升高且出现DEACMP者血清caspase-3水平高于痊愈者；血清caspase-3水平与ACMP患者昏迷程度相关，是DEACMP的独立影响因素，对DEACMP患者具有一定预测价值；但本研究是小样本量的单中心研究，结果结论存在选择性偏倚，后续仍需联合多中心、大样本量的研究进一步证实；其次，患者CO中毒时间并不能明确，且未就ACMP患者发病急性期血清caspase-3水平进行动态监测，而仅于患者入院次日清晨留取标本进行检测，故患者从CO中毒到样本收集的时间存在差异，可能对结果造成影响。

作者贡献：刘莹莹、屈永才进行文章的构思与设计，撰写论文，并对文章整体负责，监督管理；刘赟、马利进行数据收集、整理、分析及结果分析与解释；屈永才负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。