益生菌与抗帕颗粒对帕金森病模型小鼠行为学影响的对比研究

王永兵，奚峰，蒋晓真，张丽娅，刘慧琴，杨娟，李刚，赵晓晖

近年随着帕金森病（Parkinson's disease，PD）的深入研究，肠道菌群在该疾病发生、发展中的作用不容忽视［1］，而通过改善肠道菌群失调有可能改善PD症状，延缓病情进展。益生菌可通过调节肠道微生物成分而影响胃肠道上皮细胞、免疫系统及肠道神经系统（包括神经元和神经胶质细胞）。抗帕颗粒的有效成分可通过减轻肠道炎性反应、抑制致病肠道细菌蛋白通过分子模拟机制而导致体内α-syn异常折叠与沉积及沿脑肠轴神经传递与沉积，从而改善便秘等PD症状，延缓病情进展。本研究通过建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）致C57BL/6小鼠PD模型，比较益生菌、抗帕颗粒（具有独立知识产权）对PD模型小鼠行为学的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018年9月—2019年10月完成实验。选取雄性SPF级健康C57BL/6小鼠111只，均由上海灵畅生物科技有限公司提供〔许可证编号：SCXK（沪）2018-0003〕，鼠龄8～12周，体质量20～22 g，在复旦大学药学院实验动物中心饲养〔许可证编号：SYXK（沪）2015-0023〕，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，工作照度 150～300 Ix，动物照度 15～20 Ix，12 h光照 /黑暗交替。

1.2 主要试剂 益生菌购自上海信谊药厂有限公司，抗帕颗粒由江苏省南通大学医学院第二附属医院提供〔批准文号：通制剂（2001）02-050〕，MPTP购自美国Sigma公司。

1.3 分组及干预方法 将111只健康C57BL/6小鼠随机分为A组（正常对照，n=20）、B1组（PD模型对照，n=20）、B2组（PD模型并益生菌干预，n=20）、B3组（PD模型并抗帕颗粒干预，n=20），B4组（PD模型并益生菌联合抗帕颗粒干预，n=20）。A组、B1组小鼠均给予0.9%氯化钠溶液1 ml/d进行灌胃，持续7 d，并正常喂养4个月。B2组小鼠给予益生菌溶液109个/d进行灌胃；B3组小鼠给予抗帕颗粒（浓度800 mg/ml）40 mg·kg-1·d-1进行灌胃；B4组小鼠给予益生菌联合抗帕颗粒进行灌胃（浓度同前），用法用量分别与B2组、B3组相同。B2组、B3组、B4组小鼠均每日上午9：00～10：00给药，称体质量1次/周，并按照体质量调整给药量，连续喂养4个月。

1.4 PD小鼠模型制备 小鼠均腹腔注射MPTP 40 mg·kg-1·d-1制造 PD 模型，持续 7 d［2］。在第 1 批制模过程中发现，50只小鼠制模后次日即死亡11只，尸体解剖显示均为肠坏死，究其原因为腹腔注射过深，穿刺入肠腔而导致肠坏死致死亡；经补充实验动物、规范穿刺方法使两批小鼠共制模成功达到80只。

1.5 行为学观察方法 分别于喂养后15 d及1、2、3、4个月每组每时间段选取8～10只小鼠在预定时点进行行为学观察，具体方法如下。

1.5.1 爬杆实验 将一直径为25 cm的软木球固定于一根长50 cm、粗1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，而后将受试小鼠放于软木球上，记录其从软木球上下来所用时间、爬完木杆上半部及下半部所用时间，再按以下标准进行计分：3 s内完成上述某一动作计3分；6 s内完成上述某一动作计2分；超过6 s完成上述某一动作计1分［3］。分值越高表明小鼠肢体运动协调越佳。

1.5.2 悬挂实验 将受试小鼠悬挂于一水平电线上，将小鼠用两后爪抓住电线计3分，用一后爪抓住电线记2分，两后爪均抓不住电线计1分［4］。分值越高表明小鼠肢体运动协调越佳，反之则提示小鼠震颤、肌强直等情况严重。

1.5.3 游泳实验 将受试小鼠放入一个20 cm×30 cm×20 cm规格的水箱中10 min，水温为22～25 ℃，受试时间为10 min。评分标准：若小鼠在受试时间内能持续不断游泳计30分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮计25分；漂浮时间占整个受试时间50%以上计20分；偶尔游泳计15分；偶尔用后肢游动并漂浮在一边计10分［5］。分值越高表明小鼠肢体运动协调越佳，反之则提示小鼠震颤、肌强直等情况严重。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，重复测量数据采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存情况 A组、B3组、B4组小鼠均存活；B1组小鼠喂养4个月时存活19只，1只进食逐渐减少并于喂养第82天衰竭死亡；B2组小鼠喂养4个月时存活18只，2只均为进食逐渐减少并分别于第68、91天衰竭死亡。

表1 五组小鼠各时间点爬杆实验分值比较（ ±s，分）Table 1 Comparison of pole test scores in the five groups at different time points

表1 五组小鼠各时间点爬杆实验分值比较（ ±s，分）Table 1 Comparison of pole test scores in the five groups at different time points

注：A组小鼠为正常，B1组小鼠为PD模型，B2组小鼠为PD模型并益生菌干预，B3组小鼠为PD模型并抗帕颗粒干预，B4组小鼠为PD模型并益生菌联合抗帕颗粒干预；与A组比较，aP＜0.05；与B1组比较，bP＜0.05；与B2组比较，cP＜0.05

组别 只数 喂养15 d后 喂养1个月后 喂养2个月后 喂养3个月后 喂养4个月后A 组 20 7.4±1.5 8.1±1.3 6.9±1.5 8.1±1.3 9.3±1.8 B1 组 19 4.0±1.2a 5.4±1.2a 4.6±1.3a 5.2±1.8a 4.1±1.2a B2 组 18 4.2±1.4a 5.7±1.2a 4.7±1.1a 6.7±1.3ab 5.9±1.3ab B3 组 20 4.0±1.3a 4.9±1.2a 6.4±1.2bc 7.4±1.4b 7.9±1.4abc B4 组 20 4.6±1.4a 5.1±1.3a 6.6±1.2bc 6.9±1.6ab 7.4±1.5abc F值 F时间=1.965，F组间=2.272，F交互=3.408 P值 P时间=0.051，P组间=0.025，P交互=0.003

2.2 爬杆实验分值 时间与方法在爬杆实验分值上存在交互作用（P＜0.05）；方法在爬杆实验分值上主效应显著（P＜0.05）；时间在爬杆实验分值上主效应不显著（P＞0.05）。B1组、B2组各时间点，B3组喂养15 d及1、4个月后，B4组喂养15 d及1、3、4个月后爬杆实验分值低于A组；B2组喂养3、4个月后，B3组、B4组喂养2、3、4个月后爬杆实验分值高于B1组；B3、B4组喂养2、4个月后爬杆实验分值高于B2组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.3 悬挂实验分值 时间与方法在悬挂实验分值上存在交互作用（P＜0.05）；时间、方法在悬挂实验分值上主效应显著（P＜0.05）。B1组各时间点，B2组喂养15 d及1、2、3个月后，B3组喂养15 d及1、2、4个月，B4组喂养15 d，1个月后悬挂实验分值低于A组；B2组、B3组、B4组喂养2、3、4个月后悬挂实验分值高于B1组；B3组喂养3个月后、B4组喂养2个月后悬挂实验分值高于B2组；B4组喂养1个月后悬挂实验分值高于B3组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.4 游泳实验分值 时间与方法在游泳实验分值上存在交互作用（P＜0.05）；方法在游泳实验分值上主效应显著（P＜0.05）；时间在游泳实验分值上主效应不显著（P＞0.05）。B1、B2组各时间点，B3组、B4组喂养15 d及1、2个月后游泳实验分值低于A组；B3、B4组喂养 3、4个月后游泳实验分值高于B1组；B3、B4组喂养3个月后游泳实验分值高于B2组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

3 讨论

PD是第二大神经系统慢性退行性疾病，而采用神经毒素MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠制备PD模型是较理想的PD模型之一［2］。本研究结果显示，A组与B1组喂养15 d～4个月后爬杆实验分值、悬挂实验分值、游泳实验分值间具有统计学差异，表明MPTP诱发C57BL/6小鼠PD模型方法简单有效，且制模效果可靠。本研究在第1批制模过程中发现，50只制模后次日即死亡11只，尸体解剖显示均为肠坏死，究其原因主要为腹腔注射深度过深，穿刺入肠腔而导致肠坏死致死亡；经补充实验动物、规范穿刺方法，第2批41只小鼠制模顺利完成。因此，MPTP腹腔注射深度及手法直接关系到制模的成败。

表2 五组小鼠各时间点悬挂实验分值比较（ ±s，分）Table 2 Comparison of traction test scores in the five groups at different time points

表2 五组小鼠各时间点悬挂实验分值比较（ ±s，分）Table 2 Comparison of traction test scores in the five groups at different time points

注：与A组比较，aP＜0.05；与B1组比较，bP＜0.05；与B2组比较，cP＜0.05；与B3组比较，dP＜0.05

组别 只数 喂养15 d后 喂养1个月后 喂养2个月后 喂养3个月后 喂养4个月后A 组 20 2.8±0.3 3.0±0.3 3.1±0.3 3.0±0.3 3.3±0.3 B1 组 19 1.7±0.6a 1.6±0.6a 1.7±0.6a 1.7±0.6a 1.6±0.7a B2 组 18 1.7±0.5a 2.0±0.5a 2.1±0.7ab 2.3±0.4ab 2.8±0.6b B3 组 20 1.6±0.8a 1.6±0.8a 2.6±0.5ab 2.9±0.4bc 3.0±0.5ab B4 组 20 1.0±0.5a 2.3±0.5ad 2.8±0.4bc 2.7±0.5b 3.0±0.4b F值 F时间=2.624，F组间=2.233，F交互=2.594 P值 P时间=0.014，P组间=0.020，P交互=0.011

表3 五组小鼠各时间点游泳实验分值比较（ ±s，分）Table 3 Comparison of swimming test scores in the five groups at different time points

表3 五组小鼠各时间点游泳实验分值比较（ ±s，分）Table 3 Comparison of swimming test scores in the five groups at different time points

注：与A组比较，aP＜0.05；与B1组比较，bP＜0.05；与B2组比较，cP＜0.05

组别 只数 喂养15 d后 喂养1个月后 喂养2个月后 喂养3个月后 喂养4个月后A 组 20 27.6±4.6 28.0±4.0 27.7±3.9 28.5±4.9 29.1±3.8 B1 组 19 16.9±7.2a 17.6±7.6a 18.9±8.0a 16.4±7.2a 17.6±8.1a B2 组 18 16.0±6.5a 18.1±7.4a 20.7±6.6a 17.8±6.6a 21.8±7.9a B3 组 20 17.0±7.1a 17.2±6.9a 20.9±5.9a 24.6±5.2bc 25.0±6.4b B4 组 20 17.0±6.4a 17.6±6.8a 21.4±5.8a 23.8±6.0bc 23.9±7.1b F值 F时间=1.981，F组间=2.315，F交互=2.049 P值 P时间=0.052，P组间=0.042，P交互=0.034

PD主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性变性丢失，主要表现为震颤、肌强直、动作迟缓、姿态平衡障碍等运动症状，但早在1817年JAMES PARKINSON描述PD患者除运动症状外的非运动症状—便秘，但并未受到临床的足够重视。肠道菌群失调可能是导致PD发生的始动因素，细菌蛋白通过分子模拟机制、免疫／炎性机制启动α-syn错误折叠，并以迷走神经为媒介沿脑-肠轴传播，进而导致PD发生［6］。因此，肠道菌群干预有可能是治疗PD的新视角。PD患者肠道菌群改变主要表现为病原菌增多、有益菌减少，变形菌增多、双歧杆菌减少，产丁酸菌群（包括瘤胃球菌属、柔嫩梭菌）减少、刺激炎性反应细菌（包括埃希菌、肠杆菌、拟杆菌、艰难梭状芽孢杆菌）增多。因此，增加有益菌、减轻炎性反应理论上有利于改善PD患者肠道微环境，进而通过脑-肠-微生物轴改善PD患者临床表现及症状［7］。本研究结果显示，B2组喂养3、4个月后爬杆实验分值高于B1组，B2组喂养2、3、4个月后悬挂实验分值高于B1组，但B1组与B2组各时间点游泳实验分值间无统计学差异，表明益生菌可一定程度改善PD小鼠爬杆、悬挂行为，但对其游泳行为改善不明显，并显示出益生菌治疗PD疗效的有限性、起效慢等特点，表明肠道微生态环境虽可对PD发生、发展起到重要作用，但部分环节及影响因素还有待于进一步深入研究。

从PD的现代发病机制分析，氧自由基与PD发病密切相关。PD患者处于氧化应激状态，脑黑质中固醇类过氧化物较正常人增多10倍，因此，预先给予抗氧化剂或含巯基的化合物可不同程度地改善PD动物行为和生化指标改变［8］。抗帕颗粒由熟地黄、山萸肉、红参、生黄芪、丹参、水蛭、全蝎、僵蚕8味中药组成，其中熟地可调节谷氨酸/γ-氨基丁酸系统递质与受体水平，维持中枢兴奋性、抑制氨基酸功能的协调平衡，还可降低脑线粒体单胺氧化酶活性，降低体内过氧化脂含量，具有一定的抗氧自由基作用［9］；山萸肉能明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸诱导的血小板聚集，同时可抑制白介素2分泌和表达；红参中的人参皂甙具有促进神经元轴突生长、清除自由基等作用，并可通过抑制氧化应激反应而对抗多巴胺所诱导的细胞凋亡［10］；生黄芪能提高网状内皮系统的吞噬功能，增加抗体分泌细胞及T、B淋巴细胞，提高自然杀伤（NK）细胞活性，具有增强机体免疫力的作用；丹参中的丹参酮类、丹参素、丹酚酸类化合物等具有较强的抗氧化、抑制炎性因子、抗氧自由基功能［11-12］；水蛭有较强的抗凝与抗血栓形成作用，并可减少血小板源生长因子等重要炎性因子产生，同时通过调节Bax/Bcl-2表达而起到抑制神经细胞凋亡的作用［13］；僵蚕中的草酸胺具有催眠、抗惊厥作用，并可提高机体免疫力［14］；全蝎可促进乙酰胆碱释放，并通过调节血栓素B2和6-酮-前列腺素F1α平衡，进而起到保护血管内皮功能、预防血栓形成的作用［15］，因此抗帕颗粒具有抗氧化应激、抗氧自由基及提高机体免疫力等作用，推测这种抗氧化作用很可能通过改善肠道微生态、保护神经元等机制在PD治疗中起重要作用。

本研究结果显示，B3组喂养2、3、4个月后爬杆实验分值、悬挂实验分值均高于B1组，表明抗帕颗粒对PD小鼠模型的行为学具有良好的改善作用，同时显示出抗帕颗粒起效慢，用药2～3个月方可见效，这与中医中药的作用特点有关；此外，B3组喂养3、4个月后游泳实验分值高于B1组，可见抗帕颗粒对PD模型小鼠游泳动作改善需要更持久、更足量的治疗，究其原因为游泳动作对肢体的协调性要求更高，因此相应的治疗要求更高。另外，本研究结果还显示，B3、B4组喂养2、4个月后爬杆实验分值高于B2组，B3组喂养3个月后、B4组喂养2个月后悬挂实验分值高于B2组，B3、B4组喂养3个月后游泳实验分值高于B2组，表明抗帕颗粒对PD模型小鼠行为学的干预较益生菌有一定优势，但在应用过程中应注意其起效慢、足量、足程等问题，因其作用的缓和性尤其是益生菌对PD模型小鼠游泳实验改善有限，故需考虑联合使用多巴制剂，以达到减慢神经元变性的目的，而联合干预较抗帕颗粒单药干预并未显现更大的疗效，有待于在进一步实验与临床中深入、细化研究。

综上所述，益生菌、抗帕颗粒对PD模型小鼠行为学均具有良好的改善作用，且抗帕颗粒较益生菌有一定优势，而二者联合并未有明显优势；但本研究纳入样本量小、干预时间短，后续仍需进一步扩大样本量、延长干预时间探寻更客观的行为学观测方法。

作者贡献：赵晓晖进行文章的构思与设计，论文的修订，并对文章整体负责，监督管理；王永兵、赵晓晖进行研究的实施与可行性分析；奚峰、张丽娅、刘慧琴进行数据收集、整理、分析；蒋晓真、杨娟、李刚进行结果分析与解释；王永兵负责撰写论文；蒋晓真负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。