微生物燃料电池传感器对土壤中重金属的检测研究

杨厚云，刘星鑫，黄显怀，余丽，王嵘

(安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601)

0 引言

重金属离子是土壤污染中主要的污染物之一，其来源主要包括大气沉降、生活垃圾、农业生产以及工业废水和废渣不合理排放，大部分分布在人口密集、经济发达地区[1]。与此同时，矿山地区大量的游离重金属离子会渗透到地下水或随雨水径流入农田中，在农田中累积，也会带来极大的危害[2]。与其他污染相比，重金属污染由于重金属离子在土壤中不易流失，且土壤中的微生物很难将其分解转化，极易造成土壤质量下降、生态环境恶化、以及通过食物链对人类的身体健康产生威胁等[3]。另外，由于重金属在土壤中具有很强的隐蔽性，人们很容易忽略这个问题，随着工业的不断发展，土壤重金属污染也更加严重[3]。正因如此，为了对土壤中重金属离子进行有效地治理，首要的就是需要对其进行检测分析。应用先进的检测技术，确定土壤中重金属污染程度，为治理提供及时有价值的信息迫在眉睫。目前，土壤中重金属污染的检测方法包括光谱法、质谱法、电化学分析法等传统检测技术，随着技术的发展，新型的检测技术也逐渐涌现，比如酶抑制法、免疫分析法和太赫兹光谱法等。但是这些方法依旧存在一些不足之处，比如费时，仪器昂贵或需要高级设备等[4]。因此，亟需建立一种简单方便、经济、高灵敏度、高选择性和快速的重金属检测方法。

微生物燃料电池(MFC)是一种利用微生物的催化氧化作用，将化学能转化为电能的技术[5]。它的原理是以有机质为电子供体，微生物在细胞内将可降解有机质分解为电子和质子，并通过呼吸链将电子分别依次传输到细胞膜和转移到阳极上，然后经外电路，将电子传递到阴极上，最后在阴极表面与电子受体结合；阳极产生的质子从阳极液通过离子交换膜扩散到阴极中，从而形成一个闭合回路，完成MFC降解有机质、电子传递和产电的过程[6，7]。微生物燃料电池技术一方面可将污水中的有机污染物去除，另一方面利用微生物的新陈代谢作用，还能产生电能，可同时实现污水处理和能源回收的效果。另外，它还具有反应条件温和、无二次污染、去除有机污染物种类多以及回收能源形式多样化等优点，使微生物燃料电池在产电、污染评价和修复等方面的研究潜能和应用前景十分广阔[8]。近年来，MFC技术在有机污水处理、产电、环境修复、海水脱盐及传感器等领域取得了一定的研究成果，显示了MFC技术在环境众多领域中具有巨大的应用潜力[9，10]。MFC传感器主要利用MFC产生的电流或者电压作为信号对被分析物分析检测。相对于传统传感器，基于MFC的传感器更易操作、更加便捷、一般无需样品预处理，其能在复杂体系中实现连续在线监测，使得这项技术具有选择性好、灵敏度高、检测成本低等优点[11]。利用MFC传感器存在以下优势：首先，MFC利用废水中的菌株就可以在MFC阳极上生长并产电；其次，产电菌能快速应对外界环境冲击，从电流或电压的变化可以明确警示废水中某一物质的影响；再次，MFC可以直接利用废水产电，使得MFC可以实现长期在线检测的可能；最后，MFC对不同种物质的冲击有不同的反应，据此可以基本判断出待测物质的类型[5]。

MFC传感器可直接利用微生物作用产生的可测量电信号来监测，不需物理和化学的转换器。主要包括以下几种常用方法实现：一是伏安法，即利用电流密度的峰值与目标物质的浓度呈一定比例关系来检测一种或者多种化学物质，具有较高的敏感性。当监测多种物质时，会出现不同的电位峰值[12]。二是电流分析法，即利用电流的变化与目标物质的浓度变化的关联性来监测分析某目标化学物质。当微生物通过新陈代谢作用分解目标物质(特别是有毒物质)时，会抑制微生物的代谢途径，从而改变电流的产生[13]。三是电势分析法，即稳定精准的参比电极产生的电势与MFC的电极电势之间的势能差来监测分析目标物质的变化，具有较高的敏感性和选择性。但是此法对参比电极要求过高，导致其实际应用受到限制[12]。目前，已有的MFC传感器主要集中于生化需氧量(BOD)检测的传感器[14，15]。Kim等人首次将MFC用于实际废水中BOD的检测，检测范围为20-206 mg·L-1。且具有较强的稳定性，可以连续运行5 a[16]。后来逐渐将MFC应用于有毒物质的检测，包括有机农药、芳香烃和金属离子等。Kim等人构建了第一个MFC毒性检测生物传感器，在连续流的情况下，分别对有机磷农药、Pb、Hg和多氯联苯进行检测，结果发现这些物质都对MFC的产电产生明显的抑制作用，其中Pb和Hg的检测范围为1-10 mg·L-1。[17]上述可见，MFC传感器可以通过采集的电流变化来间接直观地反映其中某些化学物质的变化情况，且相比较而言，研究成本较低，反应信号直观可靠。除此之外，还有利用MFC传感器检测抗生素、挥发性脂肪酸、溶解氧以及温度等，极大拓展了MFC传感器的应用范围[18]。

本研究构建双室MFC传感器，以四种较为常见的重金属离子：Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+为研究对象，利用MFC分别对污染土壤中的金属离子进行检测。根据电流分析法，研究各重金属离子对MFC产电的影响，并通过调控重金属离子的浓度来研究金属离子浓度与电流之间的关系，最后进一步分析该MFC传感器对重金属离子检测的可行性，从而为污染土壤中重金属离子的快速检测提供参考。

1 实验部分

1.1 实验装置MFC搭建

本研究使用的MFC是H型圆筒玻璃双室反应器，如图1所示，共两个反应器。两个80 mL的圆筒形极室被阳离子交换膜(CMI7000，膜国际有限公司，美国)分为阳极室和阴极室。阳离子交换膜用之前需置于0.5 M NaCl溶液中40°C浸泡20 h使其充分膨胀和活化。阳极和阴极电极材料均为4×5 cm2的碳毡，两极室中分别加入60 mL和50 mL的营养液。碳毡预处理是将其置于5%硫酸中80°C处理2 h，以去除碳毡上金属离子等杂质，减少对实验结果的影响，之后用蒸馏水清洗干净后晾干备用。阴阳两极通过直径为1 mm的钛丝连接外电路，经测量钛丝与碳毡之间的内阻小于5.0 Ω。Ag/AgCl参比电极(高仕睿联，天津)放置于阳极室中，用于监测阳极电流，用橡胶塞密封两极室以及固定电极。实验中通过电化学工作站进行在线电流监测。

MFC阳极接种处理淀粉废水的厌氧污泥，以乙酸钠为底物富集产电微生物。阳极中加入的培养液成分见先前报道[19]，阴极室中同样加入50 mL此培养液。除此之外，阴阳两极液中还包括50 mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)以及增加两极液体离子强度所需的100 mM KCl。另外，为了保持阳极液混合良好和避免产生浓度梯度，阳极用磁力搅拌器进行搅拌，速度为450 r·min-1。为了保证阳极室中微生物所需的厌氧条件，每次换完培养基后对阳极室曝氮气30 min。待驯化完成后，分别往阳极注入已曝氮气处理后的不同浓度重金属离子进行实验。

图1 实验所用的MFC反应器示意图

1.2 试剂与仪器

试剂：常规试剂以及三种重金属离子药剂(Mn-Cl2·4H2O、CuCl2·2H2O、FeCl2·4H2O)都购自天津市红岩化学试剂厂，CdCl2·2.5H2O购自天津市大茂化学试剂厂，以上试剂均为分析纯。

污泥和重金属离子溶液：污泥取自山东淀粉废水处理厂，用于MFC阳极产电菌富集的种泥；四种重金属离子溶液用化学药剂人工配制来模拟污染土壤重金属淋洗液。各离子浓度的选取，参考已有文献报道[6]。

仪器：上海辰华CHI1000C电化学工作站，AL204电子天平，洁康数码超声波清洗机，上海三申DZ10Z不锈钢电热蒸馏水器，湖南赫西H/T16MM台式高速离心机，上海驰久84-1磁力搅拌器，大龙单道可调移液器，美国FEI公司SIRION2000扫描电子显微镜(SEM)。

1.3 SEM检测样品前处理

从两个反应器阳极上切下大小为0.3×0.3 mm2的碳毡样品，首先在4°C 5%戊二醛溶液中浸泡12 h，然后用不同梯度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、95%和 100%)逐步脱水，每次脱水15 min；分析前样品需要干燥和镀金。

1.4 实验方法

1.4.1 MFC反应器产电菌驯化

MFC反应器搭建完成后，每隔3-5 d更换一次培养液，方法是将阳极液全部取出并离心，倒掉上清液，保留底部污泥并加入新培养基冲洗后返回到阳极室中。每次更换阳极液的同时，阴极液也一并更换，驯化一个月左右，通过观察电流的变化来判断驯化是否成功。所有实验都在常温下进行。

1.4.2 不同金属离子对MFC产电的影响

待驯化结束后，分别依次向MFC阳极中注入一定浓度的 Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+四种重金属离子溶液，观察每种重金属离子对MFC产电的影响。每种重金属离子做完之后，同时更换阴极和阳极液，阳极液曝氮气(N2)30 min以使阳极室保持厌氧。待MFC产电稳定之后，进行下一种重金属离子对MFC产电的影响。

1.4.3 重金属离子浓度与MFC电流变化的相关性

在确定重金属离子对MFC产电有影响之后，尝试探讨重金属离子浓度与MFC电流变化的相关性。四种离子分别取不同浓度梯度，注入到MFC阳极室中，观察电流的变化，探讨重金属离子浓度与电流变化差值的相关性。实验操作同1.4.2。电流差值的计算方法是用注入金属离子后MFC达到稳定后的电流值减去注入金属离子前的MFC电流值，取绝对值即得。

2 结果与讨论

2.1 MFC反应器产电菌的驯化

分别对两个反应器，进行一个月左右驯化后，得到电流随着时间的变化曲线以及阳极电极材料碳毡上微生物变化情况，如图2所示。从图2(a)和图2(b)中可以看出，前半个月的运行周期中，每次换完培养基、运行后，两个反应器(1#和2#)产生的电流都存在较大的波动，说明此时阳极中产电菌还未在碳毡上形成成熟的生物膜；通过定期更换培养液，继续培养半个月，发现两个反应器在每次换完培养液运行后，电流波动逐渐消失而变的平稳，基本维持在0.014～0.015 mA之间。结果表明，此时产电菌在碳毡电极上已经形成成熟的生物膜[20，21]。

图2 实验所用的MFC反应器驯化电流图

通过对驯化前后阳极电极材料碳毡进行SEM表征，其结果同样也佐证上述结果。图3(a)为空白碳毡SEM图，从图中可以看出，碳毡表面比较光滑，无微生物附着；而经过一个月驯化后，原来光滑的碳毡表面上明显的有微生物附着(见图3(b)和图3(c))。根据前述实验结果可知，产电菌已驯化完成，两个反应器运行已达到稳定状态，可以开展后续实验。

2.2 不同金属离子对MFC产电的影响

根据已有文献中的报道[6]，本实验分别选取了一定浓度的四种常见重金属离子(Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+)作为目标土壤重金属污染物来研究它们对1#MFC反应器产电的影响，结果如图4所示。从图4中可以看出，当不同重金属离子注入MFC阳极中时，MFC电流就会突然增加，随后会下降至一定值。结果表明当有重金属离子进入MFC阳极室时，MFC可以通过电流的变化来进行响应，反应灵敏。为了验证实验的重复性，不同重金属离子至少重复3次以上注入至MFC阳极中。从图中可以看出，随着每次不同重金属离子注入，MFC电流都会有不同程度的响应(电流变化差值大于0.002 mA)，具有一定的重复性。另外，从图4(a)中可以看出，当Fe2+注入MFC阳极后，MFC电流最后达到平稳时，比注入之前有一定的增加。这可能是因为MFC阳极中微生物可以利用Fe2+，使得重金属本身具有的化学能转化为电能的缘故，进而促进MFC产电[5]；另外，也有研究发现，金属离子可以有效地改善阳极微生物在电极上的附着和核黄素的生成，增加了MFC中阳极微生物的胞外电子传递过程[22]。而其它三种重金属离子注入后的平稳电流较注入前都会略有降低(见图4(b)、图4(c)和图4(d))，说明这些重金属离子不能被MFC阳极微生物利用，反而可能会对微生物代谢有抑制作用，使微生物的酶钝化，使之失活，造成产电下降[18]。上述结果表明MFC可用作对土壤中重金属离子的实时检测，且具有一定的灵敏性和重复性。

图3 阳极电极材料碳毡SEM表征图

2.3 重金属离子浓度与MFC产电变化的相关性

据文献报道，在一定条件下，MFC的电流与阳极室中的可代谢底物的浓度及微生物数量成正比，且不同底物对MFC阳极微生物的生长与电流变化影响均不同[18]。因此，本实验对四种不同重金属离子浓度与2#MFC产电变化值的相关性进行了研究，结果见表1所示。从表中可以看出，随着不同重金属离子浓度的增加，对应的电流值差值(增加或降低)都随之变大。

为了进一步研究重金属离子浓度与电流变化差值的相关性，本实验以各重金属离子的浓度为横坐标，电流差值为纵坐标，得到了四种重金属离子浓度与MFC电流变化差值的线性拟合关系，见图5所示。从图中可以看出线性拟合后得到线性方程的相关系数R2均大于0.980，表明重金属离子浓度与MFC电流变化差值存在很好的线性关系，并可用于验证MFC传感器的稳定性。这与文献中研究其他重金属离子浓度与MFC电流变化差值得到的线性方程的相关系数R2非常接近，部分结果甚至高于文献报道的数值[5，23]。上述结果表明MFC传感器不仅可以实现土壤中重金属离子的在线快速检测，还可以通过重金属离子浓度与MFC电流变化差值存在的线性关系测出土壤中重金属离子的浓度，实现定量检测分析，4种重金属(Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+)的检测范围为 9～40、30～50、2～10、2～10 mg L-1。通过比较发现，本实验Cu2+的检测下限明显优于高艳梅等人的研究结果，但是Cd2+的检测下限高于高艳梅等人的研究[5]。根据王洁芙等人的报道可知，在一定重金属离子浓度范围内，MFC的自我修复能力可实现电流在下降后仍能恢复至稳定水平，即存在检测安全浓度范围。并在安全浓度范围内，MFC传感器检测重金属离子具有可重复性和长期性[18]。但由于MFC中电化学细菌的新陈代谢和对毒性的适应能力是有限的，若金属离子浓度过高会对MFC造成不可逆的毒害，因此可将高浓度离子通过稀释至安全浓度范围内等方法来解决这一问题。此外，MFC对重金属离子的检测存在检测下限，对浓度过低的金属离子会存在不能定性和定量检测的问题[18]。本结论是MFC定量分析重金属离子浓度的初步研究，可为MFC传感器的实际应用提供理论基础。实际土壤中的重金属不是单一的，且成分复杂。若将此传感器运用到实际过程中，还需要进一步的探索和优化，包括此方法的稳定性、灵敏性和精确性等方面。

表1 四种重金属离子浓度与MFC产电变化差值

图4 不同重金属离子对MFC产电的影响

图5 四种金属离子浓度与MFC电流变化差值的线性关系

3 结论与展望

本实验构建的双室MFC传感器通过重金属离子对微生物代谢的作用，可快速检测污染土壤中重金属离子的存在，具有操作方便，灵敏度高，可连续在线检测等优点。根据实验选取四种重金属离子的实验结果可以看出，在一定浓度范围内，有些重金属离子(如Fe2+)可以被微生物利用来提高MFC产电性能，而大多数重金属离子(如Cu2+、Mn2+、Cd2+)会对微生物产生毒害作用来抑制MFC产电性能。通过比较发现，实验结果与其他研究者研究结果保持一致。重金属离子促进MFC产电主要是通过金属离子促进微生物自身代谢和与电极之间的电子传递过程来实现；重金属离子抑制MFC产电则是有毒物质进入MFC后抑制产电菌的代谢过程造成的。同时在一定检测范围内，重金属离子浓度与MFC产电变化差值有很好的线性关系(R2＞0.980)，其原理主要是在一定条件下，MFC的产电量或电流与阳极添加的可代谢底物的浓度或电活性菌数量成正比。这为MFC传感器对污染土壤中重金属定量检测提供了理论基础。也说明了MFC传感器用于污染土壤中重金属离子的检测具有较好的适用性。后续实验拟从寻找MFC电极材料和离子交换膜替代材料等来进一步提高传感器性能，深入研究典型干扰物对MFC性能的影响，基于大量实验绘出干扰补偿曲线，用以修正金属离子浓度检测拟合曲线，提高MFC传感器的可靠性和长久性。

近年来，MFC传感器作为一种新型的检测技术，在在线检测和现场快速检测方面都展示了巨大的优势。然而，由于存在诸如产电效率低、抗干扰性差和成本高等技术方面的不足，大部分MFC传感器依旧还停留在实验室阶段，只有极少部分MFC传感器可在实际中应用。另外，目前MFC传感器只能对某一已知重金属离子进行检测，对含有多种未知浓度的金属离子的样品，不能定性和定量检测，特异性低。鉴于此，未来MFC传感器应从提高灵敏度、构建特异性MFC传感器、增加MFC稳定性和恢复能力以及开发可降低MFC构造成本等方面和MFC对金属离子的相关作用机制进行深入的研究，为促进MFC传感器在实际应用中，特别是污染土壤应用方面的推广奠定前期基础。随着MFC技术的深入研究，相信得到一种响应快、灵敏度高、价格低廉的MFC传感器指日可待。