雷公藤甲素热敏醇质体的制备工艺*

罗国平，孟会宁，闫梦茹，王小宁，薛倩倩，陈 程，高祎凡，马远涛，陈梦圆

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021； 2.山东步长医药销售有限公司，山东 菏泽 274418)

DOI：10.16664/j.cnki.issn1008-0511.20200108.001网络出版时间：2020-01-08 08:52:00

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/22.1268.TQ.20200108.0851.002.html

类风湿关节炎(RA) 是自身免疫性疾病的一种，其病因尚不完全明确，其特征为慢性进展性的关节滑膜炎症，引起关节疼痛和肿胀，若病情未得到较好的控制与治疗，将会导致关节畸形和残疾及多器官功能衰竭[1]。因此，RA的治疗是研究者一直想要攻破的难题[2]。

雷公藤具有祛风除湿、消肿止痛、通络止痛的功效[3]。临床上常用雷公藤治疗类风湿性关节炎、麻风反应等。雷公藤甲素(TP)又名雷公藤内酯，是中药雷公藤的主要活性成分，具有显著的免疫抑制、抗炎、抗肿瘤和抗生育等活性。目前投入临床上使用的TP单体制剂较少，常用的是雷公藤片和雷公藤多苷片，但不同厂家甚至同一厂家不同批号的药物其TP含量相差较大，加上雷公藤片和多苷片中成分复杂，不易控制，降低了用药的安全性。因此，研究TP单体制剂显得非常有意义。但是，TP存在难溶于水，生物利用度低、有效治疗量小、治疗窗窄等缺点，这些缺点是其具有肝脏、肾、心脏和生殖系统等多脏器毒性的主要原因之一[4-5]。为此，作者考虑通过改变给药方式和改进剂型来克服以上问题，即将TP包载于热敏醇质体中并制成经皮给药的凝胶剂。热敏醇质体是一种新型药物载体，除具备醇质体的特点外(如能延长药物作用时间，降低药物的毒性，提高治疗指数，同时其良好的变形性和流动性可促进药物的穿透性，是一种高效的透皮载体[6-7])，还具有热敏性，即当外界温度低于质膜磷脂液晶态的相变温度(tm)时，包载在热敏醇质体中的药物基本不释放，而当外界温度大于或者等于tm时，膜的流动性和通透性均会增大，内部被包载的药物大量快速释放，形成较高药物浓度[8]，提高药物的治疗效果。作者主要介绍雷公藤甲素热敏醇质体的制备工艺。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

雷公藤甲素原料药：质量分数96.8%，西安汇林生物科技有限公司；雷公藤甲素对照品：批号B20709，上海源叶生物科技有限公司；大豆卵磷脂、胆固醇：药用规格，山东巨荣生物工程有限公司；乙醇：体积分数95%，1,2-丙二醇：分析纯，天津永晟精细化工有限公司；吐温-80：化学纯，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；透析袋：6 mm，截留分子质量14 000Da。

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司；高效液相色谱仪：Agilent 1260，美国安捷伦科技有限公司；台式高速离心机：TG-1650-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；超声波清洗机：SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平：BT125D，赛多斯科学仪器(北京)有限公司；马尔文激光粒度仪：ZEN-3600Malvern，英国马尔文仪器有限公司；恒温培养振荡器：ZHWY-100B，上海智城分析仪器制造有限公司；差示扫描量热仪：DSC1，METTLER-TOLEDO。

1.2 实验方法

1.2.1ρ(雷公藤甲素)的测定

采用HPLC法，色谱柱：Agilent 5 TC-C18，150 mm×4.6 mm；流动相：V(水)∶V(甲醇)=40∶60；检测波长：218 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别进样20 μL，记录色谱图。另取雷公藤甲素对照品，加甲醇分别配成质量浓度为0、19.92、33.20、53.12、79.68 μg/mL的对照品溶液，分别进样20 μL，记录峰面积(A)，以雷公藤甲素的质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。

1.2.2 复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体的制备

天然大豆卵磷脂和胆固醇制备醇质体具备一定的热敏性能，且其安全易得、价格低廉、性质稳定易于保存，适合普遍应用，故选用大豆卵磷脂和胆固醇为囊材制备热敏醇质体[9-10]。采用乙醇注入-超声法[11-12]：取TP原料药、大豆卵磷脂、胆固醇适量，精密称定，置于烧杯中，加入20 mL二醇相(无水乙醇和1,2-丙二醇)，超声溶解作为油相；取24 mL磷酸盐缓冲液 (PBS)作为水相，用注射器吸取水相溶液，搅拌(转速为100 r/min)条件下，于液面以下缓慢匀速注入到上述预热至30 ℃的油相中，继续搅拌一定时间，取出并超声处理(250 W，40 kHz)一定时间，冷藏，备用。

1.2.3 热敏醇质体制备工艺优化

1.2.3.1 囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)的考察

(1)不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对热敏性的影响

分别按照1.2.2方法制备复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，其中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1、9∶1、12∶1，其他条件一样。热敏性评价方法分别采用DSC法和体外释药法。

DSC法：分别取上述制备的3组复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，离心，取沉淀真空干燥后置于铝制坩埚内，在体积分数99.99% N2氛围下，升温速度为1 ℃/min，在25～50 ℃检测热敏醇质体的热量变化。

体外释药法：采用透析法[13]进行体外释药实验。分别取上述制备的3组复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体2 g，放入经处理的透析袋中，扎紧透析袋两端，将透析袋放入100 mL含有体积分数1%聚山梨酯-80的PBS溶液(pH=7.4)中，分别于25、37和43 ℃ 3个温度条件下测定释放度，取样时间点分别为0.5、1.5、3.0、5.0、8.0、12.0 h，以时间为横坐标，累积释药率为纵坐标绘制释药曲线，通过对比不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)制备的醇质体在不同温度条件下的释药曲线来分析其热敏性能。

(2)不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对雷公藤甲素包封率的影响[14]

分别按照1.2.2方法制备复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，其中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1、9∶1、12∶1，其他条件不变。雷公藤甲素的包封率测定采用超速离心法，计算公式见式(1)。

(1)

式中：mt为投入的雷公藤甲素质量，mg；mr为未包封进入醇质体内的雷公藤甲素质量，mg。

1.2.3.2V(无水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)的考察

(1)V(无水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)对包封率的影响

分别按照1.2.2方法制备复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，其中V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他条件不变，分别测定雷公藤甲素的包封率。

(2)V(无水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)对变形性的影响

分别按照1.2.2方法制备复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，其中V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他条件不变。醇质体变形性的测定方法为取5 mL雷公藤甲素热敏醇质体混悬液和5 mL PBS，分别测定在0.8 MPa的压力下每1 min通过0.22 μm微孔滤膜的体积，变形性(D)的计算公式见式(2)。

(2)

式中：V1表示复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体在1 min内通过的体积，mL；V2表示PBS溶液在1min内通过的体积，mL。

1.2.3.3 超声时间对平均粒径和粒径分布的影响

分别按照1.2.2方法制备复方雷公藤甲素光动力-热敏醇质体，其中V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他条件不变。测定雷公藤甲素光动力-热敏醇质体的平均粒径和粒径分布系数(PDI)。

2 结果与讨论

2.1 ρ(雷公藤甲素)的测定

取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别进样20 μL，记录色谱图见图1。

由图1可知，在上述色谱条件下，供试品溶液中雷公藤甲素的色谱峰与杂质峰之间能得到很好的分离，且辅料对主药的测定无干扰，方法专属性良好。以雷公藤甲素的质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归得回归方程为A=25 268ρ-2.601 4，r=0.999 9，说明ρ(雷公藤甲素)=0～79.68 μg/mL线性关系良好。

t/min图1 对照品、供试品和阴性对照溶液的色谱图

2.2 囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)的考察

2.2.1 不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对热敏性的影响

DSC法：不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)制备的醇质体DSC图见图2。

t/℃图2 不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)制备的醇质体DSC图

由图2可知，随着大豆卵磷脂的比例逐渐减小，热敏特性越来越明显，相变温度tm值也略有升高。当m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1时，热敏性最明显，tm=42.4 ℃。

体外释药法：不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)制备的醇质体分别在25、37 和43 ℃ 3个温度条件下测定雷公藤甲素的累积释药率结果见图3。

由图3可知，3种醇质体随着释放介质温度的升高雷公藤甲素的释药率和释药速率均随之增大，在25 ℃和37 ℃，3种醇质体的释药曲线在5 h内几乎重叠，5～12 h内的释药曲线也相差很小，且12 h内的累积释药率均未超过50%；在43 ℃，3种醇质体中雷公藤甲素在不同时间点的累积释药率和释药速率均明显比25 ℃和37 ℃大，其中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1组明显快于其余2组，其在0～5 h释放速度快，5～12 h明显减慢，且12 h内累积释药率达90.92%。

t/ha t=25 ℃

t/hb t=37 ℃

t/hc t=43 ℃图3 不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)制备的醇质体在不同温度下的释药曲线

由此表明，以大豆卵磷脂与胆固醇作为醇质体的囊材具有一定的热敏特性，m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1，热敏性最显著；该结果和DSC检测结果相吻合。另外，从醇质体的稳定性来看，在室温保存条件下，醇质体较为稳定，包载的药物不易泄露。

2.2.2 不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对雷公藤甲素包封率的影响

不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对雷公藤甲素包封率的影响，结果见图4。

m(大豆孵磷脂)∶m(胆固醇)图4 不同m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)对包封率的影响

由图4可知，大豆卵磷脂的用量逐渐增大时，包封率明显减小。m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1时包封率最高，达94.78%，载药量在此时也最大，故选择m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1。

2.3 V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)的考察

2.3.1V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对包封率的影响

V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对包封率的影响，结果见图5。

V(无水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)图5 V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对包封率的影响

由图5可知，随着1,2-丙二醇比例的增多(乙醇的比例减少)，包封率逐渐减小，V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3时包封率最高。是由于醇相与药物在醇质体夹层中存在竞争作用，当1,2-丙二醇比例增加时，乙醇的比例会减少，导致膜材和夹层中药物的溶解度都降低，影响对药物的包封，导致药物包封率降低。

2.3.2V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对变形性的影响

V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对变形性的影响，结果见图6。

V(无水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)图6 V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)对变形性的影响

由图6可知，随着1,2-丙二醇比例的增大(乙醇的比例减少)，变形性减弱，V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3时变形性最好。

2.4 超声时间对平均粒径和PDI的影响

超声时间对平均粒径和PDI的影响，结果见图7和图8。

超声时间/min图7 超声时间对平均粒径的影响

超声时间/min图8 超声时间对PDI的影响

由图7可知，随着超声时间的增长，粒径有逐渐减小的趋势，但差异较小。由图8可知，PDI随着超声时间的增加而降低，说明粒径分布的均匀性越来越好；特别是超声时间在10～15 min，PDI随时间的增加而显著降低，故选择超声时间为15 min。

3 结 论

作者以大豆卵磷脂和胆固醇为囊材，无水乙醇和1,2-丙二醇为柔软剂，采用乙醇注入-超声法制备雷公藤甲素热敏醇质体，分别以热敏性、包封率、变形性和粒度分布等为指标优化了雷公藤甲素热敏醇质体制备工艺的条件，囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(胆固醇)=6∶1，柔软剂V(无水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3，超声处理时间为15 min。通过DSC法测试雷公藤甲素热敏醇质体的相变温度为42.4 ℃，体外释药法测试结果表明，雷公藤甲素热敏醇质体具有良好的热敏性能。雷公藤甲素热敏醇质体可作为一种皮肤外用给药系统，除具有良好的热敏特性和透皮性能外[14-15]，预期还具有定位释药、避免全身给药的不足和降低毒副作用等优点，同时兼具热疗和药物治疗双重特性，将给类风湿性关节炎的治疗提供一种新剂型和新制剂。