p-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用机制

李 路，李 蔚，车金鑫，欧阳秋丽，陶能国*

（湘潭大学化工学院生物与食品工程系，湖南 湘潭 411105）

柑橘是世界上重要的经济作物之一，近10多年来，我国柑橘的栽培面积、产量均居世界第一[1]。采后柑橘果实在贮运过程中极易受到病原菌如指状青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）的侵染[2-3]。近年来，柑橘酸腐病在各地的发病率逐渐提高，特别是在果实褪绿阶段和多雨季节，造成巨大经济损失[4]。目前，柑橘酸腐病的防治仍以化学杀菌剂为主，邻苯基苯酚钠、双胍盐和丙环唑虽表现出较好的防控效果，但化学杀菌剂存在损害果实品质、对人体致癌及部分国家法律限制等影响[5]。因此，急需筛选和开发安全、高效的杀菌剂用于柑橘采后酸腐病的防治。

近年来，植物精油类果蔬防腐保鲜剂的研究和应用广受关注。植物精油又称香精油、芳香油和挥发油，是从植物组织中提取的一类有较强挥发性的植物次生代谢产物。因其具有较强的抑菌能力、毒性低、对环境影响小等优点，被视为传统合成杀菌剂的替代物[6]。据报道，一些精油对果蔬采后病原真菌的生长和病害的防控均表现出良好的应用前景，如肉桂精油对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、苹果青霉病菌（P. expansum）等重要果蔬致病真菌的菌丝生长和孢子萌发具有较强的抑制作用[7];柑橘精油通过破坏意大利青霉（P. italicum）和指状青霉（P. digitatum）菌丝体的细胞膜完整性，导致胞内组分外泄，从而抑制病原菌生长[8];百里香精油能延缓番茄采后灰霉病、桃果实褐腐病、芒果焦腐病的发病进程[9-11];茶树精油不仅能抑制病原菌生长，还能通过提高活性氧和抗氧化酶水平来增强草莓果实本身的抗病性，从而显著降低草莓灰霉病和软腐病的病情指数[12]。

茴香精油是从茴香（Foeniculum vulgareMill.）植株的根、叶、果实等部位提取的一类化学组分，具有抑菌和抗氧化活性[13-14]，已在临床治疗和食品保鲜中有初步应用[15-16]。p-茴香醛是茴香精油中的重要组分。研究表明，p-茴香醛对多种白色念珠菌属（Candidasp.）菌株表现出较好的抑制效果，最低抑菌质量浓度从250～600 µg/mL不等[17]。Caccioni等[18]研究发现，p-茴香醛对多种果蔬采后致病真菌有不同程度的抑制作用，其中，抑制灰霉病菌（B. cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）和桃软腐病菌（Rhizopus stolonifer）孢子萌发的最低质量浓度为1 000 µg/mL，抑制指状青霉（P. digitatum）孢子萌发的最低质量浓度为500 µg/mL，抑制梨形毛霉（Mucor piriformis）、扩展青霉（P. expansum）和意大利青霉（P. italicum）孢子萌发的最低质量浓度为250 µg/mL;抑制上述病原菌菌丝体生长的最低质量浓度均为1 000 µg/mL。

本研究拟通过倍半稀释法评价p-茴香醛对柑橘酸腐病菌的体外抑菌效果;并通过活体实验测定p-茴香醛对人工接种酸腐病菌的柑橘果实发病情况的防控效果;进一步从病原菌菌丝体细胞壁完整性、细胞膜通透性和形态学角度对p-茴香醛抑制酸腐病菌的作用机制进行初步分析，为柑橘采后酸腐病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii），分离自柑橘酸腐病发病果实，保存于湘潭大学化工学院生物食品工程系。

砂糖橘（Citrus reticulateBlanco）于2018年11月购自湘潭大学周边柑橘种植园。

p-茴香醛（分析纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司;碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液（1 mg/mL）北京索莱宝科技有限公司;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒 贝博（上海）生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WFZ UV-2802S紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司;Nikon DS-FI2荧光显微镜 尼康仪器（上海）有限公司;F97 pro荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司;JSM-6360LV高低真空扫描电子显微镜日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

菌种的活化：将-80 ℃保存的柑橘酸腐病菌在PDA平板上进行活化，置于恒温培养箱中（28±2）℃培养4～5 d。

孢子悬浮液的配制：在平板中加入灭菌水刮取菌丝和孢子，灭菌擦镜纸滤除菌丝后，用血球计数板将孢子悬浮液调至5×106个/mL。

1.3.2 酸腐病菌生长情况分析

采用倍半稀释法测定p-茴香醛对酸腐病菌生长的影响[8]。在灭菌后的PDA培养基中加入p-茴香醛，使其终质量浓度分别为0（对照）、0.14、0.28、0.56、1.12、2.24 g/L和4.48 g/L。加入体积分数0.05%吐温-80，混匀后迅速倒入培养皿，制成含药平板。用打孔器打取直径6 mm的酸腐病菌菌饼，并将菌饼倒贴在含药平板中央，置于恒温培养箱中（28±2）℃培养5 d。用十字交叉法每日测量菌落直径。培养2 d后菌丝生长完全被抑制的p-茴香醛最低质量浓度定义为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），培养4 d后菌丝生长完全被抑制的p-茴香醛最低质量浓度定义为最低杀菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC）。按公式（1）计算p-茴香醛对酸腐病菌的生长抑制率。

式中：dc为对照组的菌落直径平均值/cm;dt为处理组的菌落直径平均值/cm。

1.3.3 采后柑橘果实酸腐病发病率测定

采用人工接种法测定p-茴香醛对柑橘果实酸腐病发病率的影响[19]。选择成熟度、大小一致且无伤口的柑橘果实，用体积分数2% NaClO浸泡2 min，灭菌水漂洗后晾干。用消毒后的手术刀在柑橘果实赤道板的位置划两个2 mm×2 mm大小、2 mm深的十字型伤口，并在伤口处接种10 µL孢子悬浮液（5×106个/mL），静置4 h。将果实浸泡在含质量浓度为0、MFC、10 MFCp-茴香醛的果蜡中5 min，每个质量浓度处理组含10 个果实，在（28±2） ℃、相对湿度85%～90%条件下保湿培养13 d，根据公式（2）计算果实发病率。

1.3.4 酸腐病菌细胞壁完整性分析

采用山梨醇保护实验测定细胞壁完整性的恢复性[20]。在含药平板中加入终浓度为0.8 mol/L的山梨醇，接种直径6 mm的菌饼，（28±2）℃恒温培养5 d，每日测定菌落直径并计算病原菌的生长抑制率。

采用AKP试剂盒测定胞外AKP活力。将0.1 mL孢子悬浮液（5×106个/mL）接种至10 mL PDB培养基中，培养1 d后，加入p-茴香醛，使其终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC，（28±2）℃恒温培养，分别在0、30、60 min和120 min后取样，4 ℃、4 000×g离心10 min，取上清液依照AKP试剂盒说明书的方法测定520 nm波长处的吸光度，并按公式（3）计算AKP活力。

式中：A1为样品管吸光度;A2为对照管吸光度;A3为标准管吸光度;A4为空白管吸光度。

1.3.5 酸腐病菌细胞膜通透性分析

采用PI染色法检测菌丝体细胞膜通透性[21]。将1 mL孢子悬浮液（5×106个/mL）重新接种于100 mL PDB培养基中，（28±2）℃恒温振荡培养1 d后收集菌丝体，悬浮于100 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.0）中。加入p-茴香醛使其终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC。（28±2）℃分别培养0、30、60 min和120 min后，将混合物4 ℃、4 000×g离心10 min，收集菌丝体。PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）冲洗2 次后，用10 µg/mL PI染色10 min，收集菌丝体并用PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）漂洗3 次除去残余染料。用激发波长和发射波长分别为546 nm和590 nm的荧光分光光度计检测菌丝体的荧光值，并用荧光显微镜进行观察和拍摄。按公式（4）将荧光值换算成相应的荧光值倍数。

式中：N为荧光值倍数;FV1为样品管荧光值;FV2为对照管荧光值。

1.3.6 酸腐病菌菌丝体形态观察

用扫描电子显微镜观察酸腐病菌菌丝体的形态[21]。按1.3.2节的方法配制p-茴香醛质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC的平板，将6 mm直径的酸腐病菌菌饼接种在平板中央，（28±2）℃培养4 d后切下菌落。用体积分数3%戊二醛磷酸盐缓冲液（pH 6.8）固定，4 ℃放置24 h。取出后用PBS（pH 6.8）进行漂洗，再分别在体积分数30%、50%、70%、95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次20 min。最后用无水乙醇处理45 min。真空冷冻干燥后喷金，用扫描电子显微镜在加速电压30 kV下观察菌丝体形态。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2010软件处理3 组平行数据，得到平均值与标准差，用Origin 7.5软件进行绘图，并用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，用Ducan新复极差测验在0.05水平分析差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 p-茴香醛对酸腐病菌生长的影响

表 1 不同处理对酸腐病菌生长抑制率的影响Table 1 Effect of different treatments on the growth inhibition rate of G. citri-aurantii

p-茴香醛处理对酸腐病菌的生长具有很强的抑制作用，对照组的生长抑制率均为0，且质量浓度越大，对病原菌的生长抑制率越高（表1）。其中，2.24 g/L和4.48 g/Lp-茴香醛对病原菌的抑制率显著高于其他质量浓度p-茴香醛处理组（P＜0.05）。培养2 d和4 d后，4.48 g/Lp-茴香醛能完全抑制病原菌的生长，因此MIC和MFC均为4.48 g/L。

2.2 p-茴香醛对采后柑橘果实酸腐病发病率的影响

人工接种4 d后，对照组和p-茴香醛处理组的柑橘果实均发生腐烂现象，随着贮存时间延长，果实发病率逐渐提高（图1）。接种后10～13 d，10 MFC（44.80 g/L）p-茴香醛处理组的果实发病率均保持在30%左右。接种13 d后，其发病率（30%）显著低于对照组和MFC（4.48 g/L）p-茴香醛处理组（100%）（P＜0.05）。说明10 MFCp-茴香醛处理能有效延缓柑橘酸腐病的发病进程。

图 1 p-茴香醛对接种酸腐病菌柑橘果实发病率的影响Fig. 1 Effect of p-anisaldehyde on the disease incidence of artificially inoculated citrus fruit

2.3 p-茴香醛对酸腐病菌细胞壁完整性的影响

外源添加保护剂山梨醇后，p-茴香醛对病原菌的生长抑制率也见表1。与未添加山梨醇的p-茴香醛处理组相比，添加山梨醇的p-茴香醛处理组菌丝生长抑制率没有显著降低，说明山梨醇不能缓解p-茴香醛对酸腐病菌生长的抑制程度。

图 2 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体胞外AKP活力的影响Fig. 2 Effect of p-anisaldehyde on extracellular AKPase activity of G. citri-aurantii

p-茴香醛处理对酸腐病菌胞外AKP活力的影响见图2。真菌细胞壁被破坏时，胞内AKP泄露至胞外，因此胞外AKP活力的变化能反映细胞壁的损伤情况。30 min后，MIC（4.48 g/L）和1/2 MIC（2.24 g/L）p-茴香醛处理组的AKP活力均显著高于对照组。MICp-茴香醛处理60 min和120 min后，病原菌胞外AKP活力分别为（3.54±0.11）U/g和（3.55±0.21）U/g，显著高于1/2 MICp-茴香醛处理组（（3.16±0.10）U/g和（3.21±0.08）U/g）和对照组（（3.11±0.19）U/g和（3.01±0.15）U/g）（P＜0.05）。综合以上结果可以看出，MICp-茴香醛能对病原菌细胞壁造成严重损伤。

2.4 p-茴香醛对酸腐病菌细胞膜通透性的影响

p-茴香醛处理对病原菌细胞膜通透性的影响见图3。由于PI染料不能穿过正常的细胞膜，因此菌丝体细胞膜损伤后，在荧光显微镜下呈红色[21]。30 min时，p-茴香醛处理的菌丝体在荧光显微镜下均未观察到明显的红色荧光（图3A），MICp-茴香醛处理组菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.53 倍（图3B）。而60 min时，MICp-茴香醛处理组的菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.49 倍，荧光显微镜下也观察到部分菌丝体呈红色，表明细胞膜被严重损伤。p-茴香醛处理120 min时，菌丝体细胞膜的破坏程度进一步加剧，此时，1/2 MICp-茴香醛处理组荧光值倍数（1.30±0.03）显著高于对照组（1.03±0.05），但显著低于MICp-茴香醛处理组（1.46±0.12）（P＜0.05）。PI染色后的荧光图片和荧光值倍数均证实p-茴香醛造成病原菌细胞膜的损伤。

图 3 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体细胞膜通透性的影响Fig. 3 Effect of p-anisaldehyde on membrane permeability of G. citri-aurantii

2.5 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体形态的影响

p-茴香醛处理对酸腐病菌菌丝体的形态有明显影响，对照组菌丝体饱满呈圆柱状，粗细均匀（图4A）;而经过p-茴香醛处理的菌丝体形态均发生改变。1/2 MICp-茴香醛处理的菌丝体表面出现明显褶皱（图4B）;MICp-茴香醛处理的菌丝体表面形态变化更为明显，呈现不规则扭曲和干瘪状（图4C）。这些变化说明质量浓度更高的p-茴香醛对菌丝体造成的损伤更大，导致胞内组分外泄。

图 4 p-茴香醛对酸腐病菌菌丝体形态的影响Fig. 4 Effect of p-anisaldehyde on morphology of G. citri-aurantii

3 讨 论

近年来，安全而高效的柑橘酸腐病防治方法（如植物精油、生防菌等）引起广泛关注[22-24]。Regnier等[22]的研究表明，1 000 μL/L孜然、柠檬草、棕榈草等9 种植物精油能完全抑制柑橘酸腐病菌的菌丝生长，并能显著降低果实发病率。Liu等[25]发现，人工接种5 d后，经3 200 μL/L百里香精油处理的温州蜜柑酸腐病发病率从78.1%降低至14.1%。Boubaker等[23]指出，供试的4 种百里香精油能不同程度地抑制柑橘酸腐病菌的生长和孢子萌发，抑菌效果与精油组分和百里香植株的种类有关。大量研究表明，茴香精油具有抑菌性，且p-茴香醛是茴香精油中的重要抑菌组分，对多种采后果蔬致病真菌有一定的抑制作用[13,18,26]。在本实验中，p-茴香醛对柑橘酸腐病菌表现出很强的抑菌性，其MIC和MFC均为4.48 g/L，且活体实验中贮存13 d的柑橘果实发病率从100%降低至30%左右，也证实了p-茴香醛对柑橘酸腐病的防治效果。值得注意的是，活体实验中的p-茴香醛抑菌质量浓度高于离体实验，这种现象在其他抑菌物质，如百里香精油、柠檬醛、壳聚（寡）糖和山梨酸钾中也有相似情况[25,27-29]。原因可能与抑菌物质的渗透能力、病原菌在人工伤口的迅速扩繁等因素有关[19,30]。

杀菌剂对致病真菌的作用位点包括细胞壁、质膜、分泌因子、氨基酸生物合成、信号组分等[31]。其中细胞壁对真菌的生长和生存适应能力至关重要[32]。AKP通常在真菌的细胞质中合成，再被分泌到周质空间中，细胞壁的损伤会造成AKP泄漏至胞外基质[21]。Shao等[32]发现茶树精油处理4 h即可造成灰霉病菌（B. cinerea）的胞外AKP活力显著上升，推断此时菌丝细胞壁已被破坏。而Tang Xu等[21]用脱氢乙酸钠处理柑橘酸腐病菌菌丝体后，胞外AKP活力并未升高，推测细胞壁不是脱氢乙酸钠的抑菌靶标。本实验中，MICp-茴香醛处理的菌丝体胞外AKP活力在60 min时显著高于对照组，表明p-茴香醛破坏了菌丝体细胞壁完整性，导致AKP外泄。山梨醇是一种常用于维持真菌细胞渗透压的保护剂，细胞壁的损伤在高渗透压下得到缓解，因此以真菌细胞壁为作用位点的化学药剂在山梨醇的保护作用下会降低其对真菌的抑制作用[33-34]。本实验中，外源添加山梨醇后，p-茴香醛对酸腐病菌菌丝的生长抑制率并没有显著降低，部分甚至增加，因此推断p-茴香醛还可能损伤病原菌细胞膜。大量研究表明，多数抑菌物质，如香芹酚、E-2-己烯醛、脱氢乙酸钠均能对病原菌细胞膜通透性造成影响，导致细胞质、核酸和蛋白质泄漏[21,35-36]。在PI染色实验中，PI通过受损的细胞膜与DNA嵌合，在荧光显微镜下观察到红色荧光;因此，荧光的强弱能一定程度反映细胞膜损伤的程度[37]。前人研究表明，多种精油的抑菌性与病原菌细胞膜通透性的增加有关[38]。本实验中，随着p-茴香醛处理质量浓度的增大和处理时间的延长，荧光逐渐增强，菌丝体细胞膜损伤程度表现出浓度依赖性和时间依赖性，表明细胞膜是p-茴香醛重要的作用位点。且30 min时，MICp-茴香醛处理组菌丝体荧光值倍数约为对照组的1.53 倍，说明此时病原菌的细胞膜已被损伤，且细胞膜损伤的发生早于细胞壁。

综上，p-茴香醛能显著抑制柑橘酸腐病菌的生长，并能有效降低柑橘果实酸腐病的发病率。p-茴香醛先损伤酸腐病菌的细胞膜，再损伤其细胞壁，造成胞内物质外泄，进而影响细胞代谢，导致菌丝体凋亡。关于其对细胞功能的影响以及分子机制，还有待于进一步分析。