帕金森病患者肠道普氏菌改变及其预测价值

张 帆，方 星，徐美玲，张 瑜，高 平，赵 强，孙晓东，桑 明，王普清

0 引 言

帕金森病是最常见的神经系统退行性疾病之一，在65岁以上中国人群的发病率约为1.7%[1-2]，其典型病理改变是黑质多巴胺能神经元细胞死亡和α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)的聚集，临床表现包括多种运动症状和非运动症状[3]。帕金森病的发病机制目前尚不明确，患者肠道功能失调发生的时间通常要早于运动症状，且肠道在a-Syn的生成和扩散过程中具有重要作用[4]，因此部分患者的帕金森病可能起始于肠道。肠道菌群能够促进小胶质细胞活化、α-syn聚集以及运动功能损害[5]，提示肠道菌群可能在疾病的发生和进展中具有重要作用。国外研究发现帕金森病患者肠道中普雷沃氏菌科和肠道普氏菌降低[6-7]，但国内的相关研究尚未达成共识；且当前的主要研究方法是16S rRNA测序，对于肠道菌群的分析具有一定的局限性[8]。本研究旨在分析帕金森患者肠道普氏菌的改变，探究其在疾病中的作用以及其对疾病的潜在诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月至2018年1月湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院神经内科就诊的46例帕金森病患者为帕金森组，及46例患者的健康配偶为对照组。帕金森组男26例，女20例，平均年龄(63.6±6.9)岁；对照组男20例，女26例，平均年龄(63.8±7.0)岁。纳入标准：依据2015年帕金森病临床诊断标准(Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson′s disease, MDS-PD Criteria)[9]诊断为原发性帕金森病；帕金森病患者和健康配偶均长期(>3年)共同居于襄阳地区，且近半年无外出旅游记录。排除标准：①糖尿病病史；②严重胃肠道疾病或手术史；③明显精神疾病病史；④近3个月服用过抗生素。本研究经湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院伦理审查委员会审查通过(批准号：2017GCP0531)，受试者签署知情同意书。所有研究对象均收集性别、年龄、饮食习惯信息，同时收集患者的临床资料，包括发病年龄、病程、家族史、非运动症状、帕金森病评定量表(unified Parkinson′s disease rating scale, UPDRS)及H-Y分期。

1.2 粪便收集和DNA提取 嘱受试者于清晨留取粪便，收集粪便于粪便微生物保存容器(上海微基公司)中，震荡混匀后迅速置于-80 ℃冰箱冻存。称重250 mg粪便用于DNA提取, DNA提取流程参照试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit, 德国Qiangen公司)说明书，所有操作均在冰上进行。利用分光光度计检测DNA的浓度和纯度，通过1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质量检测，合格的DNA保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 宏基因组测序 微生物DNA在干冰冷藏下运输至武汉华大基因公司，将样本随机打断后得到350 bp左右的片段，3′端加上“A”碱基，两端加上文库接头后进行线性扩增。取适量扩增产物进行单链分离和环化处理，质控合格后利用华大测序平台BGISEQ-500进行高通量测序，生成原始数据。

1.4 生物信息分析 首先通过FastQC(v 0.11.8)软件对原始数据进行质量评估，下一步利用bowtie2(v 2.3.5.1)去除宿主序列，索引序列为UCSC(University of California Santa Cruz)人类参考基因组的hg38版本。去宿主的序列参照MetaPhlAn[10]流程以得到物种丰度信息。把年龄分为<60岁、60～70岁、>70岁，分别比较各年龄段的丰度差异。参照HUMAnN2(The HMP Unified Metabolic Analysis Network 2, v 0.99)[11]流程分析功能基因和代谢通路组成。

2 结 果

2.1 肠道菌群组成差异 共鉴定出8个门、19个纲、29个目、60个科及142个属和399种已知细菌。进一步从2组样本的种水平维恩图显示,帕金森组、对照组分别鉴定出334、369种细菌，其中304种细菌为2组共有。帕金森组包含30种特有菌种，而对照组包含65种特有菌种。

根据物种相对丰度组成，分析2组间肠道菌群组成的差异显示，平均相对丰度最高的前5的科中，帕金森组普雷沃氏菌科相对丰度较对照组明显降低(9.70%vs16.16%，P<0.05)，而拟杆菌科、肠杆菌科、瘤胃菌科和毛螺菌科差异无统计学意义(P>0.05)。平均相对丰度最高的15个种中，帕金森组肠道普氏菌(8.22%)、脆弱类杆菌(1.00%)较对照组(15.73%、3.63%)明显降低(P<0.05)；粪便拟杆菌(7.75%)、大肠埃希菌(5.52%)、粪副拟杆菌(2.02%)较对照组(3.31%、3.31%、1.36%)明显升高(P<0.05)。

2.2 不同年龄组间肠道普氏菌相对丰度差异 60～70岁和>70岁年龄组帕金森组的肠道普氏菌相对丰度较对照组明显下降(P<0.05)，并且随着年龄的增加，帕金森组肠道普氏菌的相对丰度呈明显下降的趋势(P<0.05)，而对照组3个年龄段的肠道普氏菌无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.3 肠道普氏菌与疾病的相关性及预测价值 相关性分析发现，肠道普氏菌与疾病的临床特征具有明显相关性(P<0.05)，与患者年龄、H-Y分期、UPDRS总分和UPDRS Ⅲ评分呈明显负相关(P<0.05)。此外，德克另支杆菌与患者年龄和H-Y分期呈明显负相关(P<0.05)，而粪便拟杆菌与病程、粪副拟杆菌与H-Y分期、大肠埃希菌与年龄有明显相关性(P<0.05)。见表2。选出2组间具有明显差异且相对丰度>0.1%的菌种，然后筛选出5种重要细菌，包括肠道普氏菌、脆弱类杆菌、德克另枝杆菌、穗状丁酸弧菌和斯氏普罗威登斯菌。根据5个菌种的相对丰度构建随机森林模型用于疾病的预测，结果显示ROC曲线的AUC为0.794(95% CI：0.696～0.872)，见图1。

年龄对照组帕金森组<60岁12.68±6.1815.23±5.50#60～70岁18.27±6.50△4.73±0.97*>70岁14.61±4.32△1.51±0.44*#

与<60岁比较，*P<0.05；与60～70岁比较，#P<0.05；与帕金森组比较，△P<0.05

表 2 肠道菌群与临床特征的相关性

Table 2 Correlation between gut microbiota and clinical features

菌群种类年龄相关系数P值病程相关系数P值H-Y分期相关系数P值UPDRS总分相关系数P值UPDRS Ⅲ评分相关系数P值肠道普氏菌-0.1260.031-0.2030.392-0.0170.035-0.3770.027-0.2560.023粪便拟杆菌-0.0360.6700.0690.0140.0100.3170.2500.3020.1050.524粪副拟杆菌-0.5900.197-0.1240.497-0.1290.040-2.5760.056-1.6730.062德克另枝杆菌-1.8410.032-0.1320.691-0.2630.024-3.4620.158-1.2240.469脆弱拟杆菌0.2470.5170.0330.821-0.0240.645-0.5240.9620.1690.822大肠埃希菌-0.2350.046-0.0400.3970.0070.652-0.3530.293-0.3450.130穗状丁酸弧菌-0.2730.226-0.1160.195-0.0470.123-0.9610.144-0.4860.270

图 1 5种菌种对帕金森病的预测价值

Figure 1 The predictive value of 5 species for Parkinson’s disease

2.4 肠道菌群功能通路改变 帕金森组肠道中与分支酸/芳香族氨基酸降解相关通路的相对丰度如对羟基苯乙酸乙酯通路和分支酸通路较对照组明显升高(P<0.05)，而合成相关通路如通路-6163、完整芳香族氨基酸通路和芳香族氨基酸通路较对照组明显减少(P<0.05)。帕金森组肠道功能的另一个显著改变是γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)降解如通路-5022相对丰度和谷氨酸脱氢酶Ⅰ通路、碳水化合物代谢(葡萄糖通路)和无机营养代谢(通路-1533)较对照组明显增加。在维生素代谢方面，2组均有维生素B1合成的增加，但帕金森组的合成通路(二磷酸硫胺通路、通路-6895)主要来自于大肠埃希菌，并且肠道中维生素B6合成通路(通路-7204)相对丰度较对照组明显升高(P<0.05)，见图2，表3。对肠道普氏菌的作用进行探究，发现有7个与之相关的功能通路，其中2组通路-5686、通路-6151和通路-7221差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

图 2 肠道微生物功能分析

Figure 2 Functional analyze of gut microbiota

表 3 肠道菌群功能通路相对丰度的比较

Table 3 Relative abundance of functional pathways between two groups

通路对照组帕金森组对羟基苯乙酸乙酯通路0.009±0.0020.030±0.007*分支酸通路0.004±0.0010.013±0.003*通路-61631.213±0.0351.090±0.043*完整芳香族氨基酸通路1.181±0.0341.062±0.036*芳香族氨基酸通路1.179±0.0331.064±0.039*通路-50220.066±0.0110.114±0.009*谷氨酸脱氢酶Ⅰ通路0.053±0.0090.093±0.011*葡萄糖通路0.069±0.0110.107±0.015*通路-15330.025±0.0050.046±0.009*通路-72040.084±0.0140.132±0.017*

与对照组比较，*P<0.05

表 4 肠道普氏菌的相关代谢通路分析比较

Table 4 Functional pathway relate to Prevotella_copri

通路名称功能简介通路的平均相对丰度(%)对照组帕金森组P值通路-2942L-赖氨酸合成途径Ⅲ0.4010.1550.101通路-5097L-赖氨酸合成途径Ⅵ0.4060.1570.096通路-5686尿苷酸生物合成0.3830.1410.031通路-6151S-腺苷甲硫氨酸循环0.4480.1660.049通路-6700喹啉生物合成0.4200.1480.080通路-7219腺嘌呤核糖核苷酸从头合成0.4870.1840.060通路-7221鸟嘌呤核糖核苷酸从头合成0.4240.1550.038

3 讨 论

本研究发现帕金森病患者肠道中的普雷沃氏菌科及肠道普氏菌相对丰度明显降低，与德国Bedarf等[6]的另一项宏基因组研究结果较为一致，目前东北[13]和台湾[14]的相关研究同样报道了普雷沃氏菌科和普氏菌属在患者肠道中降低的现象，提示普雷沃氏菌科的降低可能是帕金森病患者肠道菌群的重要特征之一。

关于普雷沃氏菌科在帕金森病中作用机制，目前主要有2种：第一种是普雷沃氏菌科参与肠道黏蛋白的合成，其丰度降低导致肠道屏障损害和通透性增加，引起细菌内毒素的暴露和肠道炎症反应，诱发肠道中α-syn的过表达，从而参与疾病的发生[15]。第二种是普雷沃氏菌科降低引起短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)合成减少，导致SCFAs对肠道神经系统的免疫调节和抗炎作用减弱[16]，进而在肠道神经炎症和帕金森病中发挥作用。

本研究相关性分析发现，肠道普氏菌等微生物与患者年龄、H-Y分期和UPDRS评分呈显著负相关，且肠道普氏菌在内的5个菌种对疾病表现出较好的预测能力，提示肠道菌群可能在帕金森病的发生和进展中具有重要作用，有望在疾病的诊断中发挥重要作用。

本研究通过对帕金森病患者与配偶的肠道功能进行比较，发现差异通路主要集中分支酸/芳香族氨基酸和γ-氨基丁酸的代谢方面。患者肠道中分支酸/芳香族氨基酸合成减少和降解增加将导致体内芳香族氨基酸如酪氨酸水平的下降，可能引起代谢产物多巴胺的减少从而在帕金森病中发挥重要作用。GABA是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，正常水平的GABA有助于维持血脑屏障的紧密性和功能，而GABA的减少将导致脑血管内平滑肌的松弛，可能会改变血脑屏障的通透性增加，引发血管炎症神经退行性病变的发生[17]。动物实验证明帕金森病模型的纹状体中GABA含量降低，而通过高频刺激能够显著提高纹状体中GABA含量[18]。此外，临床研究发现合并幻觉的帕金森病患者枕叶中GABA水平明显下降[19]。这些结果提示GABA减少可能是疾病的重要生化改变之一，并且与疾病的临床表现具有一定相关性。

进一步分析发现肠道普氏菌的作用可能涉及尿苷酸生物合成、S-腺苷甲硫氨酸循环和鸟嘌呤核糖核苷酸从头合成。研究证明口服尿苷酸能够增加啮齿类动物脑内突触膜和突触小棘，提高6-OHDA模型大鼠纹状体内多巴胺水平和酪氨酸羟化酶活性，部分恢复多巴胺能神经传递[20]。S-腺苷甲硫氨酸能够通过提高血浆中硫化氢(H2S)水平降低小胶质聚集和神经炎症反应，从而发挥中枢神经保护作用[21]。因此患者肠道普氏菌的减少将会导致多巴胺能神经传递和神经保护作用的降低，参与帕金森病的发生和进展。

综上所述，本研究验证了帕金森病患者普雷沃氏菌科和肠道普氏菌的改变，探究了差异菌群与疾病临床特征的相关性及其对疾病的预测价值，同时还发现了帕金森病患者肠道功能的改变和肠道普氏菌的在疾病中的可能作用，这些结果将有助于帕金森病相关机制的进一步研究。但本研究还存在以下局限性：①样本量较小且来自同一区域，限制了结果的广泛适用性；②功能通路分析尚处于理论阶段，缺乏一定的实验支持；③研究仅限于单一时期，未来将尝试对患者的不同阶段进行纵向研究。从临床角度考虑，寻找菌群标志物可能为疾病的早期诊断提供新方法，改变菌群组成以及特定代谢产物的补充可能为疾病的治疗提供新思路。