乙型肝炎病毒重组酶聚合酶等温扩增闭管可视化检测方法及装置

陈 杉，马雪萍，谢春梅，邹秉杰，齐谢敏，周国华

0 引 言

血清病原学检查是临床普遍使用的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)检测方法之一，但由于该方法存在检测窗口期长及灵敏度低等限制因素易造成漏检[1-2]。基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的HBV核酸检测弥补了血清学检查的不足，极大缩短了检测窗口期，提高了HBV筛查的准确性[3-4]。然而，PCR技术需要依赖精密的升降温设备，使其难以在资源匮乏的地区推广使用。

近年来兴起的核酸等温扩增技术克服了对快速升降温设备的依赖，仅需在恒定的温度下即可实现对靶标核酸的高灵敏扩增检测，非常适合于建立病原体现场快速检测方法[5-6]。其中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)可在37～42 ℃恒温条件下30 min内完成高灵敏的核酸扩增[7]，比其他恒温扩增检测方法更有优势。

RPA技术通过重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的协同作用完成双链DNA模板的指数扩增[8]。在辅助因子T4 UvsY的协助下，重组酶T4 UvsX与引物结合形成核酸-蛋白复合物，该复合物在双链DNA中搜寻同源序列，一旦找到就会入侵双链DNA从而引发链置换反应，被置换下来的互补链与单链结合蛋白结合保持单链状态。随后，重组酶从核酸-蛋白复合物中脱离，随即与新的引物结合去开启新的链置换反应，同时DNA聚合酶(Bsu)从引物末端3＇OH开始合成延伸，使两条亲本链继续分离，结合正向和反向引物可同时在两个方向合成子链DNA，不断循环最终实现扩增产物的指数积累。虽然RPA的扩增速度快、灵敏度高、反应条件温和，非常适合于核酸现场快速检测，但如何实现扩增产物的准确检测是RPA技术走向现场检测所面临的挑战。

传统的凝胶电泳方法虽然能实现对RPA产物的检测，但操作繁琐、开管操作易产生交叉污染，不适于现场快速检测[8]。Exo荧光探针法是目前RPA产物检测最常用的方法，它是在RPA体系中加入exo核酸外切酶III和exo探针, 利用探针特异性识别扩增产物进而引发外切酶切割探针产生荧光信号，实时监测RPA扩增产物，产生类似于荧光定量PCR中的荧光扩增曲线，实现对待测靶标的高特异检测[9-10]。然而，该方法依然需要昂贵的实时荧光检测仪器，增加了检测成本。虽然采用侧流层析试纸条技术可对RPA产物进行可视化检测[11-12]，但开管操作易产生交叉污染，尽管利用一次性卡套装置可实现在封闭的腔体内完成试纸条检测过程，降低了交叉污染的风险，但每管RPA产物均需额外的卡套装置无疑增加了耗材成本。因此，开发一种简便的闭管可视化RPA检测方法会更有利于RPA技术应用于病原体现场快速检测。

本研究设计了一种RPA产物可视化检测装置，RPA反应结束后将反应管放入该装置中，通过手机拍照即可实现肉眼可视化判读检测结果。以HBV为检测对象，根据HBV S基因特异保守序列设计RPA引物及exo探针[13-14]，采用实时荧光RPA方法优化反应条件，建立了高效扩增HBV靶标的实时RPA扩增检测体系，并利用研制的RPA产物可视化检测装置，实现了30 min内可视化检测HBV病毒DNA，为HBV核酸快速检测提供了新方法，也为开发基于RPA的血液HBV现场即时筛查平台提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 引物、探针与质粒 根据HBV编码S基因特异保守序列分别设计6条RPA上下游引物及1条探针，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。HBV(GenBank 登录号:NC_003977)、HCV(GenBank 登录号:NC_004102)、HIV(GenBank 登录号:NC_001802)、TP(GenBank 登录号:NC_010741)、H1N1(GenBank 登录号:NC_026433.1)、H5N1(GenBank 登录号:AF509026.2)和HPV16(GenBank 登录号:NC_001526.4)核酸序列的质粒均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 样本 为了验证方法的临床检测可行性，收集了20份东部战区总医院临床HBV检测剩余的废弃血清样本用于检测。

1.1.3 仪器及试剂 血清病毒DNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；RPA反应试剂盒TwistAmp Liquid exo kit购自英国TwistDx公司；德国Qiagen 公司Rotor-Gene Q仪器用于等温孵育和实时荧光信号采集。

1.2 方法

1.2.1 RPA产物可视化检测装置的设计 便携式RPA产物可视化检测装置为一小体积暗盒(长、宽、高分别为112、90、100 mm)，盒内设置有两个包含(470±20) nm滤光片的LED激发光源，暗盒顶部设计有一个带有(520±10) nm滤光片的信号采集窗口，将RPA扩增30 min后的反应管放置在暗盒底部，用手机在信号采集窗口拍摄反应管内的荧光信号即可实现对RPA检测结果的肉眼可视化判读，并可通过荧光灰度值(ImageJ软件分析)对检测结果进行进一步的分析。整个装置由锂电池充电宝供电，便于现场使用。见图1。

图1 RPA产物可视化检测装置示意图

Figure 1 Schematic diagram of RPA product visualized detection device

1.2.2 RPA扩增体系的配制 在200 μL反应管中配制反应混合液，其中每个RPA反应体系为：10 μL 2×Reaction Buffer(试剂盒提供)；1.8 mmol/L dNTPs; 2 μL 10×Probe E-mix(试剂盒提供)；各0.84 μL上下游引物(10 μmol / L); 0.24 μL 探针(10 μmol / L)，涡旋混匀，加入1 μL 20×Core Reaction Mix(试剂盒提供)，颠倒混匀后，再加入0.4 μL 50×Exo(试剂盒提供)，颠倒混匀，最后将1 μL醋酸镁(280 mmol/L，试剂盒提供)和1 μL模板加到管盖上不同位置后，离心颠倒混匀。将配制好的反应管放入qPCR仪器中39 ℃恒温反应30 min，每30 s读取荧光信号1次。

1.2.3 RPA引物的筛选 针对HBV靶标分别设计了各3条上下游引物和一条探针(HBV-F1:GTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACC；HBV-F2:CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGC；HBV-F3:CTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGA；HBV-R1:AGCAGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCC； HBV-R2:CAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAG；HBV-R3：AAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAGACACATCC；HBV-probe：TGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACC[T(FAM)]CC[THF]A[T(BHQ1)]CACTCACCAACC TCT-SpacerC3。[T(FAM)]代表FAM荧光基团修饰的T碱基；[THF]代表四氢呋喃位点；[T(BHQ1)]代表BHQ荧光淬灭基团修饰的T碱基；SpacerC3为3＇端的封闭基团)。将HBV 的3条上游引物(F1、F2和F3)分别与3条下游引物(R1、R2和R3)两两搭配成9种组合来扩增103与102拷贝的靶标质粒DNA，选择扩增曲线最早抬起的F1+R3作为最佳引物组合，用于后续方法的建立。

1.2.4 反应条件的优化 用筛选得到的最佳引物探针组合分别在30、35、37、39及42 ℃这5个温度下扩增104、103拷贝的HBV质粒模板,选择扩增曲线最早抬起的39 ℃作为反应的最适温度，用于后续方法的考察。

1.2.5 特异性考察 用筛选出的HBV引物探针组合来扩增HBV及其他常见的病原体HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1的104拷贝的质粒模板，采用可视化检测装置对结果进行判读，并与实时荧光RPA法进行比较，以考察所建立方法的特异性。

1.2.6 灵敏度考察 将HBV质粒模板分别梯度稀释至105、104、103、102、101和100拷贝，进行RPA扩增，采用可视化检测装置对结果进行判读，并与实时荧光法进行比较，以考察所建立方法的灵敏度。

1.2.7 临床样本的检测 根据核酸提取试剂盒(磁珠法)步骤提取血清样本中的HBV DNA。在1.5 mL的离心管中加入25 μL 磁珠，20 μL 蛋白酶K、500 μL裂解液及200 μL样本，60 ℃水浴15 min，混匀数次；将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，移走管内液体；分别用700 μL洗涤液A/B 洗涤磁珠，用磁力架吸附磁珠后移走液体；用50～100 μL洗脱液重悬磁珠，65 ℃水浴5 min, 轻轻摇晃使核酸洗脱下来；最后用磁力架吸附磁珠，将液体转移至新的无核酸酶的离心管中，-20 ℃保存。对20份血清样本中提取到的病毒DNA进行RPA扩增，采用可视化检测装置对结果进行判读，并与实时荧光法进行比较，以考察所建立方法的临床适用性。

2 结 果

2.1 特异性考察 仅有HBV模板出现了比其他模板更强的肉眼可见的荧光信号，图像灰度值计算结果也证实了这一结果；实时荧光检测结果也仅有HBV模板产生了扩增曲线，HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1质粒模板与空白对照均未产生明显的扩增曲线。见图2。

2.2 灵敏度考察 10拷贝以上的模板均能显示明显区别于阴性对照的荧光信号，单拷贝模板的荧光信号也略强于阴性对照，图像灰度值与肉眼判断的结果一致。实时荧光扩增曲线的抬起时间随着拷贝数降低而逐渐延长，低至101拷贝的HBV质粒模板也能产生良好的扩增信号曲线，单拷贝(100)数量级的靶标也有扩增信号抬起，可与阴性对照区分，表明所建立的HBV RPA检测方法可检测低至1-10拷贝的HBV靶标。RPA检测HBV质粒模板的起始浓度的Log值与扩增曲线抬起时间的线性相关系数R2为0.963 3。见图3。

2.3 临床样本的检测 用肉眼即可准确判断S1-S5为阳性样本，S6-S10为阴性样本，图像灰度值与肉眼判断的结果相同；实时荧光结果中S1-S5样本得到了RPA扩增曲线，见图4。表明这5例样本为HBV阳性，S6-S10样本无信号产生，表明为HBV阴性样本。20份样本的检测结果与商品化qPCR试剂盒检测结果完全一致(阳性均为11份、阴性均为9份)。初步验证了所构建的可视化检测装置结合建立的HBV核酸RPA扩增法可实现对临床样本的检测。

a:RPA产物可视化检测装置检测结果；b:荧光灰度值结果，与空白对照比较，*P<0.01；c:实时荧光信号曲线

图2 HBV-RPA扩增法检测多种病原体的质粒模板

Figure 2 The method of HBV-RPA detected multiple pathogens plasmid template.

a:RPA产物可视化检测装置检测结果； b:荧光灰度值结果，(与阴性对照比较，*P<0.05、**P<0.01)； c:RPA扩增实时荧光信号曲线

图3 HBV-RPA扩增方法灵敏度检测结果

Figure 3 Sensitivity of HBV-RPA detection method

a:RPA产物可视化检测结果； b:荧光灰度值结果；c:实时荧光信号曲线

S1-S10为样本编号；P：HBV阳性对照；N：空白对照

图4 10例血清DNA样本的RPA检测结果

Figure 4 RPA results of 10 serum DNA samples

3 讨 论

多年来，乙肝一直是危害我国公共卫生安全的重大疾病之一。快速检测HBV对乙肝的预防和诊断具有重要意义[15-16]。尽管荧光定量PCR法已被公认为是HBV检测最可靠的方法，但其依赖精密的热循环仪，不利于现场快速检测。因此，基于等温扩增的核酸检测方法在现场快速病原体检测中更受青睐[5-6]。其中，RPA技术因其反应条件温和(37～42 ℃)、扩增速度快(15～30 min)、灵敏度高而成为核酸等温扩增技术中的佼佼者[7-8,17]。本研究通过设计优化HBV-RPA扩增引物与反应条件，建立了基于RPA的HBV核酸扩增方法，实现了在39 ℃下30 min内对低至1～10拷贝的HBV靶标DNA的扩增检测，也表明RPA反应相比于其他核酸扩增方法具有扩增速度快，对温控设备的要求低，扩增灵敏度高等优点，适合于病原体核酸现场快速扩增检测。另一方面，HBV扩增检测的RPA引物与探针的特异性良好，不会受其他可能同存在于血液中的病毒核酸序列的干扰。一般地，核酸扩增与检测的特异性还与反应温度有关，温度越低其特异性往往不尽如意[18]。但RPA反应由于依赖重组酶的序列识别特性[19]，其特异性足以在较低反应温度下区分不同序列的病原体靶标，这也为RPA进行病原体检测提供了有力保证。

然而，传统的RPA技术需要依赖实时荧光检测设备，仪器成本高，不易推广。RPA反应的定量性能也无法与PCR媲美，这主要由于RPA扩增完全依赖多种酶促反应的速率，其扩增动力学不像PCR那样完全依赖于反应循环数[3]，所以很难通过扩增抬起时间对靶标进行定量。因此，采用实时荧光法监测RPA反应不仅增加了仪器成本，而且难以准确定量，并不是RPA检测的理想方法。基于侧流层析试纸条的方法虽然实现了对RPA产物的可视化检测，但开管操作带来了扩增产物交叉污染的风险，而利用专用的防污染卡套无疑增加了耗材投入。因而，本研究设计制作了一种简易的RPA产物可视化检测装置，结合建立的HBV-RPA扩增体系，可实现手机拍照、肉眼即可判读检测HBV-RPA扩增产物的结果。该方法不仅极大降低了RPA应用时的仪器要求，同时避免了开管检测导致的产物交叉污染的风险，进一步为开发基于RPA的病原体现场快速筛查技术平台奠定了基础。

基于RPA的HBV核酸可视化检测方法对20份临床血清DNA样本的检测结果与传统的qPCR结果一致，表明该方法具有临床应用的潜力。虽然该方法具有简便快速、灵敏特异、仪器成本低的优点，但难以实现HBV的定量，并不适用于HBV临床治疗的疗效评估。但鉴于其在较低温度下即可进行恒温扩增，对加热装置的要求也十分简单，后续可进一步改进所设计的RPA产物可视化检测装置，整合现场快速核酸提取和恒温加热模块，将进一步为开发血液HBV现场快速筛查检测平台提供有力的技术支撑。