针吸细胞学联合qPCR技术诊断肺外结核病的价值

王 莉， 郝颖华， 刘 平， 陈修文， 汤显斌

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)病理科，十堰 442000

目前，结核病仍然是严重威胁人类健康的传染病。2016年WHO发布的统计数据显示，仅2015年，全球范围内就有1 000多万的新发结核病患者，180万人死于结核[1]。结核病的病原菌为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)[2]。最常见的感染部位是肺，而发生在肺外的结核感染更为隐匿，易漏诊[3]。

患者因须明确病变性质到病理科行细胞学检查，其中相当一部分为可疑肺外结核病。本科采用针吸细胞学(fine needle aspiration cytology，FNAC)联合实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)做出诊断与鉴别，效果满意，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择湖北省十堰市太和医院2016年4月至2018年12月经FNAC涂片显示为可疑结核病感染或需排除结核病感染的患者57例。其中，男性28例、女性29例，年龄15～77岁，中位年龄39岁。样本来源于表浅可触及体表囊肿的穿刺液，其中淋巴结46例，关节腔2例，泌尿生殖系统4例，胸腹壁5例。

1.2 FNAC检查 常规局部消毒，用左手拇指及示指固定穿刺部位，右手持10 mL一次性塑料注射器(7号针头)前后左右多方向穿刺取材。将部分穿刺液均匀涂抹于载玻片上，95%乙醇固定，苏木精-伊红(H-E)染色，在BX51生物显微镜(奥林巴斯)下观察。其余穿刺液预留，用于qPCR检测。

1.3 提取DNA 在穿刺液中加入2～3倍体积的4%NaOH溶液，37℃水浴0.5～1 h，至完全液化。16 000×g离心10 min，弃上清，加入1 mL 0.9%氯化钠液并一起移入1.5 mL离心管中。16 000 ×g离心10 min，弃上清，根据沉淀量加入30～50 μL DNA提取液，吹打混匀，37℃水浴30 min，再100℃干浴10 min，16 000 ×g离心10 min，取上清检测DNA。

1.4 qPCR检测 荧光定量PCR仪购自ABI公司(ABI7500)；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自qiagen公司。qPCR反应总体系为40 μL，包括反应液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG 0.06 μL及待测DNA样本2 μL。设阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照。PCR反应条件：37℃去除污染5 min；94℃预变性1 min；95℃变性5 s、60℃退火加延伸30 s，共40个循环。实验结果按照说明书进行判读。

2 结 果

2.1 临床诊断结果 57例可能感染或需排除感染结核分枝杆菌的患者中，判断倾向结核者43例，倾向其他但需排除结核者14例。57例中有临床确诊结果者23例，其中结核分枝杆菌阳性16例、阴性7例(表1)。

表1 样本检测结果比较

2.2 FNAC初筛结果 57例样本中，FNAC检测为结核阳性43例、阴性14例，诊断符合率为82.61%(19/23)；假阴性3例、假阳性1例(表1、图1)。

2.3 qPCR检测结果 57例样本中，qPCR检测为结核分枝杆菌阳性42例、阴性15例，诊断符合率为86.96%(20/23)；假阴性2例、假阳性1例(表1、图2)。

图1 组织结核分枝杆菌FNAC检查结果(H-E染色)

A：阳性，可见坏死；B：阳性，可见朗汉斯巨细胞；C：阴性，仅见大量淋巴细胞. Original magnifications: ×10(A、B), ×20(C)

图2 结核分枝杆菌qPCR典型检测结果

2.4 FNAC与qPCR联合诊断结果 有临床确诊结果的23例患者中，FNAC联合qPCR检测为结核阳性16例、阴性7例，诊断符合率为92.98%(22/23)；假阳性1例(表1)。

3 讨 论

肺外结核病指发生在肺以外的结核病，发生率占结核病的12.0%～28.5%[4]。肺外结核病的临床表现多不典型，诊断有一定困难。传统的检测方法，如痰涂片找抗酸杆菌、抗酸染色等阳性率低，且结核杆菌培养法周期很长，难以满足临床需要[5]。

与其他检测方法相比，FNAC具有检测快速、创伤小、费用低、特异性高和敏感性高的优点。Saatian等的研究[6]中，100例颈部包块的FNAC检测结果与组织病理检测的符合率可达79%。本研究中，FNAC的阳性预测值为92.86%(13/14)，阴性预测值为66.67%(6/9)，诊断符合率为82.61%(19/23)，与上述研究相似。结核病的细胞学表现多为均匀粉染的彻底性坏死，可见类上皮细胞或郎汉斯巨细胞[7]。但结核病有时与其他类上皮细胞肉芽肿难以鉴别，如真菌感染、结节病等；也可能与某些化脓性感染难以区分，如有液化坏死或混合感染时，也可见脓细胞和坏死物[8]。因此，诊断结核病时，需将FNAC与其他检测方法联合应用。

qPCR可特异性地扩增模板DNA上的一段序列，并通过荧光标记的探针实时记录扩增产物的量，具有操作简便、敏感、特异的优点。目前，qPCR法已广泛应用于石蜡包埋组织样本中结核杆菌核酸的检测[9-10]，效果较好，但在穿刺液中的应用还鲜有报道。本研究采用的qPCR试剂盒包含dUTP-UNG酶防污染系统，可有效降低假阳性。在有临床确诊结果的23例患者中，qPCR的阳性预测值为93.33%(14/15)，阴性预测值为75%(6/8)，与临床诊断的符合率达86.96%(20/23)，本研究中qPCR对结核分枝杆菌感染的检测率较高除了与其准确率较高有关外，还与前期FNAC筛选及例数较少有一定关系。为避免漏诊，建议对所有FNAC涂片镜检时发现有类上皮细胞，伴或不伴坏死的样本行qPCR检测。

综上所述，FNAC是诊断肺外结核病，尤其是有体表囊肿的肺外结核病的首选手段，可在减轻患者痛苦的基础上减少漏诊。将FNAC和qPCR法联合用于肺外结核病，可提高诊断准确率。