生物质热解液和腐霉利混配对番茄灰霉病的防病作用及机理研究

李 泳， 吴委林， 颜尘栋， 王 薇， 韩 玉， 李熙英

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

番茄灰霉病是灰葡萄菌(Botrytiscinerea)侵染引起的病害，其特点是传播速度快、危害重等[1]。20世纪80年代，灰霉病在我国零星出现并在短时间内迅速蔓延开来，目前为止，该病在全国主要番茄保护地均有发生[2]。番茄灰霉病集中出现在我国黄淮沿海地区、东北以及西北内陆地区的保护地，病高发期可导致大田番茄产量损失大约为总产量的1/3，病发的年份产量可损失3/4左右[3]。现阶段番茄灰霉病的防治主要是以腐霉利等药剂的化学防治，但化学防治常造成《3R》问题以及污染水土、人畜中毒、农田生态平衡与生物多样性的破坏等一系列社会问题[4]。所以，需要寻找一种对环境友好的防治方法。

生物质热解液(农废热解液)是利用快速热解技术处理生物质(秸秆、枯枝等)原料获得的生物油精制过程中分离得到的水溶性物质，其理化特性[5]类似于木(竹)醋液。国内外对木醋液在植物病害防治[6-8]等方面有较多的研究报道；沈国娟等[9]研究表明，生物质热解液与银法利混配可以提高辣椒疫病的协同防病作用，并能减少银法利的用量；韩玉等[10]在生物质热解液与多菌量混配对水稻纹枯病的防病作用中也得到与沈国娟等相似的结论。但尚未见有关生物质热解液以及与化学农药混配对番茄灰霉病防病作用以及机理方面的研究报道。该试验研究了生物质热解液和腐霉利混配对番茄灰霉病的协同防病作用及机理，为减少化学农药使用量的前提下防治番茄灰霉病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1) 供试培养基： PDA培养基。

2) 供试菌种：试病原菌为番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，由延边大学植物病理研究室保存。

3) 生物质热解液热解液(简称为农废热解液)：由延边大学食品科学系提供。

4) 供试番茄品种：中蔬4号，无限生长型。

5) 50%腐霉利：日本住友化学株式会社生产。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度的生物质热解液和腐霉利对番茄灰霉病菌的抑菌作用

采用含毒介质培养法，将生物质热解液原液和腐霉利加入到PDA中制作生物质热解液浓度分别为1、2、4、5、6、8和10 mL/L的含生物质热解液PDA培养基和腐霉利浓度为0.1、0.5、0.8、1、5、8和10 mg/L的含腐霉利PDA培养基。含药平板中央放置1片直径为7 mm的番茄灰霉病菌菌饼，以纯PDA为对照，重复5个培养皿，放入25 ℃恒温培养箱中培养，2 d后开始用十字交叉法测病菌菌落直径，取对照菌落长满平板时的数据计算抑菌率。并建立毒力回归方程，计算EC50值。

1.2.2 生物质热解液与腐霉利最佳配比的筛选

以腐霉利和生物质热解液的EC50浓度为基准，将生物质热解液∶腐霉利按照10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10的比例混配测定抑菌率。具体试验方法同1.2.1。若毒力比率明显大于1，为增效作用；若毒力比率明显小于1，为拮抗作用；毒力率为1左右，则为相加作用。计算菌落生长后连续3 d内的毒力比率。

预期抑制生长率=(单剂A的EC50剂量实际抑制生长率×配比中的百分率)+(单剂B的EC50剂量实际抑制生长率×配比中的百分率)

采用1.2.1的方法，在前面试验中筛选的几组毒力比率大、有增效作用的混配建立毒力回归方程以及计算EC50值。所得结果采用孙云沛方法(1960)计算共毒系数(CTC)[7]。若共毒系数明显大于100表示增效作用；明显小于100表示拮抗作用；接近100表示相加作用。

1.2.3 生物质热解液和腐霉利混配对番茄果实灰霉病的防病作用

选择长势均匀、无机械损害的平均直径为3 cm左右的新鲜番茄果实，用自来水反复冲洗，自然晾干后用70%的酒精进行表面消毒，晾干备用。

用已灭菌的接种针在番茄果面中部刺3个伤口，每伤口处滴20 μL灰霉病菌孢子悬浮液(400倍视野100左右孢子)，待孢子悬浮液阴干后进行药剂处理。具体为：生物质热解液EC50浓度、腐霉利EC50浓度、生物质热解液EC50浓度和腐霉利1/4 EC50浓度的混配液、生物质热解液EC50浓度和腐霉利1/2 EC50浓度混配液、生物质热解液EC50和腐霉利EC50混配浓度的1∶9混配液，每伤口处滴20 μL。每个处理24个果实，3次重复。待晾干后用保鲜膜密封保湿置于25 ℃恒温箱中，每天进行观察，10 d后，统计番茄果实上的病斑直径、发病率，计算病情指数和防治效果。

病果分级标准[11]：病斑直径以十字交叉法测定。

0级:无病斑;

1级:果实病斑直径<0.5 cm;

2级:果实病斑直径为0.6～1 cm;

3级:果实病斑直径为1.1～1.5 cm;

4级:果实病斑直径为1.6～2 cm;

5级: 果实病斑直径>2 cm。

1.2.4 生物质热解液和腐霉利混配对番茄灰霉病菌菌丝细胞通透性的影响

称取PDA培养基上培养8 d的番茄灰霉病菌菌丝进行测试。电导率的测定采用吴方丽等[12]人的方法；细胞蛋白质和核酸类物质外渗的测定参照徐俊光等[13]人的方法。处理2 h时测相应的值。

1.2.5 生物质热解液和腐霉利混配对番茄灰霉病菌菌丝生理代谢的影响

称取PDA培养基上培养8 d的番茄灰霉病菌菌丝进行测试。总糖含量的测定采用蒽酮试剂法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[14]；蛋白酶活性测定采用福林酚法[15]；几丁质酶活性的测定参考Boller等[16]人的方法；β-1,3-葡聚糖酶活性的测定采用余永廷等[17]人的方法。

1.2.6 抑菌作用的显微观察

EC80浓度的生物质热解液、腐霉利及两者混剂(1∶9)与番茄灰霉病菌进行平板抑菌试验，培养4 d后，病菌菌丝生长受抑制部位用显微镜观察并拍照。

1.2.7 生物质热解液和腐霉利混配对番茄叶片的POD、SOD、CAT的活性及叶绿素含量的的影响

春季田间移栽番茄苗。移栽时株行距为25 cm×40 cm，每株定植2株，移栽后进行正常的田间管理。缓苗1周后开始喷浓度均为EC80的腐霉利、生物质芯热解液、生物质热解液和腐霉利及两者混剂(1∶9)，每隔7 d喷施1次，共喷2次，每棵第1次喷施的药液量为20 mL/株，第2次喷施药液量为40 mL/株。每个处理10株，重复3次。测定处理7 d后的番茄叶片POD、SOD、CAT酶活性和叶绿素含量。过氧化物酶(POD)的活性用略有调整的愈创木酚法进行测定[18]，超氧化物歧化酶(SOD)的活性用NBT法进行测定[13]，过氧化氢酶(CAT)的活性用紫外吸收法进行测定。叶绿素含量的测定采用SPAD-502叶绿素仪测定。

2 结果与分析

2.1 生物质热解液和腐霉利对番茄灰霉病菌的室内抑菌作用

由图1可知，不同浓度的生物质热解液对番茄灰霉病菌均有抑菌作用，其抑菌率随着浓度的升高有明显增加的趋势。当生物质热解液的浓度为10 mL/L时，对番茄灰霉病菌的抑菌率为100%。

图1 不同浓度生物质热解液对番茄灰霉病菌的抑制作用

由图2可知，不同浓度的腐霉利对番茄灰霉病菌均有抑菌作用，其抑菌率随着浓度的升高有明显增加的趋势。当腐霉利的浓度为10 mL/L时，对番茄灰霉病病菌的抑菌率达到了97.09%。

根据图1，2的数据建立的生物质热解液和腐霉利对番茄灰霉病菌的毒理方程和EC50值见表1。

由表1可知，毒力方程相关系数均大于0.95，说明毒力回归方程的拟合性较好，有较大的可信度。根据毒力回归方程求得的腐霉利和生物质热解液的EC50值分别为1.879 3和2.943 5 mg/L，说明生物质热解液和腐霉利对番茄灰霉病菌有较强抑菌作用，其中腐霉利的抑菌作用强于生物质热解液。

图2 不同浓度腐霉利对番茄灰霉病菌的抑制作用

表1 生物质热解液与腐霉利单剂对番茄灰霉病菌的毒理测定结果

2.2 生物质热解液和腐霉利混配最佳配比筛选

由表2可见，生物质热解液和腐霉利配比为1∶9和3∶7时，毒力比率在持续的2 d均大于1，说明两者的混配效果为协同增效作用；生物质热解液和腐霉利配比为2∶8时，毒力比率在1左右，说明两者混配效果为相加作用；其它混配比下毒力比率明显小于1，说明两者混配效果为拮抗作用。

表2 生物质热解液与腐霉利最佳配比的毒力比率

续表2 生物质热解液与腐霉利最佳配比的毒力比率

生物质热解液与腐霉利1∶9和3∶7混配的毒力回归方程、EC50值以及共毒系数(CTC)见表3。

由表3可见，相关系数均大于0.96，说明毒力回归方程拟合的较好。当混配比例为1∶9时的EC50值(0.85 mL/L)小于混配比例为3∶7时的EC50值(2.26 mL/L)。

根据上面所求得2种单剂的EC50值和混剂的EC50值，计算的1∶9混配的共毒系数(CTC)为296.00，明显大于100；3∶7混配的共毒系数(CTC)为58.18，远小于100。这进一步说明，生物质热解液和腐霉利1∶9配比具有明显的增效作用。

表3 生物质热解液与腐霉利单剂对番茄灰霉病菌的毒理测定结果

2.3 生物质热解液和腐霉利混配对番茄离体果实灰霉病的防病作用

由表4可知，生物质热解液、腐霉利以及混剂处理的番茄果实病情指数均显著低于对照。其中，生物质热解液腐霉和腐霉利1∶9混剂处理防效最高，在EC50浓度下的防效为69.36%；其次为生物质热解液的EC50+1/2浓度腐霉利EC50的防效，其防效为60.17%；再次为生物质热解液EC50+1/4浓度腐霉利EC50和EC50浓度腐霉利处理的防效，其防效分别为55.88%和55.07%；生物质热解液对番茄灰霉病的防效最低。从中可见，加生物质热解液的条件下，含25%腐霉利EC50浓度的混剂与单用EC50浓度的腐霉利单剂有相同的防效；含50%腐霉利EC50浓度时的混剂防效显著高于只用EC50浓度的腐霉利的防效。说明生物质热解液与腐霉利混配对番茄灰霉病有明显的增效防病作用和减农药作用。

表4 生物质热解液、腐霉利及混剂对番茄果实灰霉病的防病作用

注：a、b、c、d、e表示在5%水平上的差异显著性，下同。

2.4 生物质热解液与腐霉利混配对番茄灰霉病菌细胞膜通透性的影响

由表5可见，不同处理的番茄灰霉病菌菌丝电导率值、蛋白质和核酸类物质外渗浓度均高于对照。其中，混剂处理过的番茄灰霉病菌丝的电导率值、蛋白质和核酸类物质外渗浓度最高，分别达到了对照的1.21倍、1.67倍和3.75倍；其次为生物质热解液处理的，分别达到了对照的1.15倍、1.33倍和1.61倍。说明混配对番茄灰霉病菌菌丝细胞膜的破坏性最强。

表5 生物质热解液与腐霉利混配对番茄灰霉病菌细胞膜通透性的影响

2.5 生物质热解液与腐霉利混剂对番茄灰霉病菌生理代谢的影响

由表6可知，不同处理的番茄灰霉病菌菌丝的总糖含量和蛋白质含量显著低于对照，其中，混剂处理总糖含量和蛋白质含量最低，分别为对照的42.31%和62.24%；其次为2种单剂处理的总糖含量和蛋白质含量。不同处理的番茄灰霉病菌菌丝的蛋白酶活性、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性显著高于对照，其中，混剂处理的蛋白酶活性、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分别为对照的2.37倍、2.68倍和1.62倍；生物质热解液处理蛋白酶活性与混剂处理的蛋白酶活性间没有显著性差异。

表6 生物质热解液与腐霉利混配对番茄灰霉病菌生理代谢的影响

2.6 生物质热解液与腐霉利混配对番茄灰霉病菌菌丝形态结构的影响

由图3可知，未经药剂处理过的正常病菌菌丝形态结构完整、分支明显、呈树枝状、呈现良好的状态；经腐霉利处理过的病菌菌丝膨大、溶菌、严重弯曲、隔膜不明显、分支减少等；生物质热解液处理的病菌菌丝扭曲、变形、溶菌；混配处理的病菌菌丝呈严重扭曲状、膨大、溶菌、分支减少等，兼具了腐霉利和生物质热解液的共同特点。

注：1为正常菌丝；2为经农药腐霉利处理后菌丝；3为经生物质热解液处理后菌丝；4为经混剂处理后菌丝。图放大倍数均为1∶400

图3 番茄灰霉病菌正常菌丝和药剂处理后菌丝的形态

Fig.3 Normal hyphal morphology of botrytis cinerea and morphology after drug treatment

2.7 生物质热解液与腐霉利混配对番茄叶片防御性酶活性及叶绿素含量的影响

由表7可知，不同处理的番茄叶片中的SOD、POD、CAT酶活性和叶绿素含量均显著高于对照。其中，混剂处理的SOD、POD、CAT酶活性及叶绿素含量最高，比对照分别提高了1.91倍、2.51倍，1.61倍和1.97倍；生物质热解液处理的SOD、POD、CAT酶活性和叶绿素含量分别比对照提高了1.33倍、1.53倍、1.30和1.51倍；腐霉利处理的SOD、POD、CAT酶活性和叶绿素含量分别比对照提高了1.24倍、2.15倍、1.13倍和1.04倍，其中腐霉利处理的CAT酶活性和叶绿素含量与对照间没有显著性差异。

表7 不同处理对番茄叶片中的POD、CAT、SOD酶活性的影响

3 讨论与结论

张军[19]和庞道睿等[20]研究发现，有机酸以及酚类物质具有较强的抑菌作用；杨超博等[21]研究发现，生物质热解液具有广谱的抑菌作用。该研究发现，生物质热解液对番茄灰霉病菌具有较强的抑菌作用，其EC50值为1.879 3 mL/L；番茄果实灰霉病的防病试验中EC50浓度生物质热解液处理的防效为47.92%。说明将生物质热解液应用到番茄灰霉病的防治中具有一定的应用价值。

该试验中，生物质热解和液腐霉利1∶9配比的EC50值明显小于生物质热解液单剂EC50值和腐霉利单剂EC50值，且共毒系数(CTC)为296.00，明显大于100。说明生物质热解液和腐霉利1∶9混配具有明显的增效作用。番茄果实灰霉病的防病试验中先用生物质热解和液腐霉利1∶9混剂处理的防效为69.36%；在混剂中减少腐霉利含量50%和75%的情况下防效仍达到了60.17%和55.88%，其中，减少腐霉利75%含量的混剂与单用腐霉利单剂有相同的防效。这进一步证明生物质热解液与腐霉利混剂对番茄灰霉病有明显增效防病作用和减农药作用。这与沈国娟等[8]在农废热解液与银法利混用对辣椒疫病的防病作用试验中得到的结果以及韩玉等[9]在农废热解液与多菌灵混用对水稻纹枯病的防病作用试验得到的结果基本吻合。

该试验中，生物质热解液、腐霉利以及它们的混剂处理的番茄灰霉病菌菌丝电导率值、蛋白质和核酸类物质外渗浓度均高于对照。其中，混剂处理过的番茄灰霉病菌丝的电导率值、蛋白质和核酸类物质外渗浓度最高，分别达到了对照的1.21倍、1.67倍和3.75倍。这一结果与张慧茹等研究发现绞股蓝内生真菌JY25 发酵液可以使致病大肠杆菌的电导率增加，使细胞膜受到明显破坏作用[22]基本一致。说明混配对番茄灰霉病菌菌丝细胞膜的破坏性最强。不同处理的番茄灰霉病菌菌丝的蛋白酶活性、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性显著高于对照，其中混剂处理的蛋白酶活性、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分别为对照的2.37倍、2.68倍和1.62倍。经生物质热解液和腐霉利混配处理的番茄灰霉病菌菌丝呈严重扭曲状、膨大、溶菌、分支减少等，兼具了经腐霉利和生物质热解液2种单剂处理的共同特点。以上可见，生物质热解液和腐霉利混剂的协同增效作用与对番茄灰霉病菌菌丝细胞膜的破坏性的提高有关。

该试验中，生物质热解液、腐霉利以及它们的混剂处理的番茄叶片中的SOD、POD、CAT酶活性和叶绿素含量均显著高于对照。其中混剂处理的SOD、POD、CAT酶活性及叶绿素含量最高，比对照分别提高了1.91倍、2.51倍、1.61倍和1.97倍。这与前人的研究结果基本一致[23-24]。说明生物质热解液和腐霉利混剂处理可以诱导番茄植株抗病性提高。