多西环素原粉与其络合制剂单次给药大鼠的药代动力学比较研究

张 雪， 李 萍， 李钰颖， 马科哲， 宋厚辉， 金庆日

(浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江 杭州 311300)

多西环素为四环素类半合成衍生物广谱抗生素，在碱性、强酸性环境下均不稳定，多西环素常以盐酸盐的形式制备，称盐酸多西环素(Doxycycline Hydrate)。多西环素主要作用位点是核糖体，通过与细菌核糖体 3S小亚基结合，干扰氨基酰 tRNA与30S小亚基结合，使氨基酰 tRNA不能进入 mRNA上的受位，从而抑制蛋白质合成时肽链的延长，使蛋白质合成受阻[1]。多西环素与天然四环素类药物(如土霉素、四环素)相比，多西环素具有抗菌活性和组织穿透力更强[2-3]、体内分布广[4-5]、生物利用度高、半衰期较长等优点，广泛应用于兽医临床[6-7]。在目前的临床应用中，普通盐酸多西环素制剂一般很难克服盐酸多西环素本身具有的几个突出缺陷，如易络合、不稳定、易耐药、低含量、性价比低等。浙江万方生物科技有限公司研制的50%盐酸多西环素络合制剂(以下简称络合制剂)，成功克服了盐酸多西环素易与金属离子络合、水溶液中不稳定及耐药性等问题。相比普通的10%盐酸多四环素，络合制剂的多西环素含量大幅提高，络合制剂更加高效，临床使用相对量减少，价格优势明显，在临床应用中可实现低投入，高效果。但尚未有关于络合制剂在实验动物或靶动物上进行药动学试验的报道。因此，该试验将用常用的实验动物大鼠进行多西环素原粉和络合制剂的药物代谢动力学(药动学)试验，计算药动学参数，阐明多西环素原粉和络合制剂在大鼠体内的药动学规律，为其临床合理应用提供理论依据。该研究的顺利进行将塑造良好的市场竞争环境，有利于盐酸多西环素药价市场化机制的形成，以供临床应用，迎合养殖市场需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1) 仪器 电子分析天平(BSA124S，上海锡为科学仪器有限公司)、高速离心机(Eppendorf centrifuge 5418，广州雷得生物技术有限公司)、磁力搅拌器(85-2，杭州仪表电机有限公司)、超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC/MS/MS，美国沃特世公司)、Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 色谱柱(美国沃特世公司)、振荡混匀器(Vortexgenie2，妙生科技有限公司)、真空浓缩仪(德国艾本德公司)、超声波清洗器(Biosafer SB-5200DT，南京赛飞生物科技有限公司)。

2) 试验动物 健康、体重相似的SPF大鼠6只，购自浙江省医学科学院实验动物中心。

3) 试剂 盐酸多西环素原粉和络合制剂由浙江惠嘉生物科技股份有限公司提供。肝素钠(Heparin sodium salt, 185 USP units/mg)、生理盐水、乙腈、甲酸、三氯乙酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司，舒泰50购自法国维克公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1) 流动相的制备

0.1%甲酸(A)∶乙腈(B) = 95∶5 (V/V)

2) 多西环素标准溶液的制备

准确称取多西环素100 mg，置于5 mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，配制成浓度为20 mg/mL标准品储备液。用流动相进行梯度稀释，获得浓度为100、250、5 000、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000 ng/mL的标准品溶液。

1.2.2 灌服给药

健康大鼠6只，在温度和湿度恒定的试验动物房(浙江农林大学动物科技学院)适应饲养 1周后，随机分为原粉组和制剂组。灌服给药前禁食12 h以上，不禁水。以25 mg/kg剂量，给其中3只灌服多西环素原粉溶液，另外3只灌服络合制剂溶液。大鼠的体重为(283±6) g。

1.2.3 给药和采血方案

大鼠施行股静脉和股动脉手术。原粉组和制剂组以25 mg/kg剂量灌服原粉和络合制剂。分别在大鼠灌服给药后0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 h，通过股动脉采集血液，每次采集0.22 mL血液并通过股静脉补充相应体积的生理盐水。将采集好的全血置于肝素纳离心管中，以8 000 r/min 离心3 min，取血浆并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 标准曲线样品的预处理

取45 μL大鼠空白血浆，置于1.5 mL离心管中，每管加5 μL标准溶液(终浓度分别为10、25、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL)，涡旋振荡混匀，13 000 r/min离心10 min，加200 μL三氯乙酸(1 mol/L)，涡旋震荡10 min，13 000 r/min 离心10 min，取上清200 μL至样品瓶，用UPLC/MS/MS检测。以多西环素标准品的终浓度为横坐标，多西环素的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 血液样品预处理与检测

取50 μL大鼠血浆样品，置于1.5 mL离心管中，加200 μL三氯乙酸(1 mol/L)，涡旋震荡10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清200 μL至样品瓶，用UPLC/MS/MS检测。

1.2.6 液相色谱条件

色谱柱Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 Column(2.1×100 mm，1.7 μm)，流动相0.1%甲酸(A)∶乙腈(B) = 95∶5 (V/V)。梯度洗脱条件：0～2 min为90% A，3～4 min为30% A，5～6 min为90% A。流速0.3 mL/min，进样体积10 μL，分析时长9 min。

1.2.7 质谱分析条件

用电喷雾离子源(ESI)，正离子(ES+)模式进行扫描，多离子反应监测(MRM)模式下进行检测。多西环素母离子的质荷比(m/z)为445.2，二级质谱子离子的质荷比为428.2和108.2，相应的碰撞电压分别为25和20 eV[8]。其他参数的设置如下：脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量800 L/hr，锥孔电压25 V，锥孔气流量50 L/hr，毛细管电压3.50 kV。

1.2.8 数据分析

用 Winnonlin 软件的非房室模型，计算各种药动学参数，如消除半衰期(t1/2)、达峰时间(Tmax)、达峰浓度(Cmax)、药-时曲线下面积(AUC)、表观分布容积(Vz)、体清除率(CL)和平均滞留时间(MRTlast)等。

2 结果与分析

2.1 质谱分析

由图1可知，在正离子模式下，母离子经能量碰撞，碎裂成2个特征性子离子。质荷比为445.2的多西环素母离子碎裂成质荷比为428.2和108.2的子离子。

图1 在正离子模式下获得的多西环素二级质谱图

2.2 多西环素血浆样品的标准曲线

多西环素标准溶液的浓度依次为10、25、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL。以多西环素标准溶液的终浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图2)。标准曲线回归方程为 Y=326 X+15 019，R2=0.992 8。

为检测UPLC/MS/MS分析方法的特异性，检测了大鼠空白血浆、多西环素标准溶液样品(500 ng/mL)和大鼠灌服络合制剂后1.5 h的血浆样品(图3a～c)。如图3a所示，大鼠空白血浆样品中没有明显的杂质峰，因此，此分析方法可应用于多西环素大鼠血浆样品的分析。如图3b,c所示，多西环素的保留时间为4.05 min，峰型对称，分离度好，无杂质峰干扰。

图2 多西环素标准曲线

2.3 大鼠灌服多西环素原粉和络合制剂溶液后的血药浓度

a为大鼠空白血浆色谱图；b为多西环素标准溶液(500 ng·mL-1)色谱图；c为大鼠灌服络合制剂后1.5 h的色谱图

图3 色谱图

Fig.3 Chromatogram

表1 灌服盐酸多西环素原粉和络合制剂后的血药浓度

图4为大鼠灌服多西环素原粉和络合制剂后的药-时曲线。由表1和图4可知，除了给药后初始阶段(0.083～0.25 h)以外，大鼠灌服络合制剂后的血药浓度均高于多西环素原粉的血药浓度。其中，大鼠灌服络合制剂后2 h的血药浓度显著高于多西环素原粉(表1)。如图4和表2所示，络合制剂的AUCall和AUCinf均大于多西环素原粉的AUCall和AUCinf，表明络合制剂在大鼠体内到达全身血液循环的量大于多西环素原粉。

图4 大鼠灌服多西环素原粉和络合制剂后的药-时曲线

2.4 药动学参数的计算

用Winnonlin软件中非房室模型，计算各种药动学参数，表2为大鼠灌服多西环素原粉和络合制剂后的药动学参数。其中，AUCall指t0到t10 h的药时曲线下面积， AUCINF指t0-t∞的药时曲线下面积，MRTlast为平均滞留时间。

注:***P<0.001。

由表2可知，大鼠灌服络合制剂后的Tmax和Cmax均大于多西环素原粉，AUCall和AUCinf也均大于多西环素原粉的AUCall和AUCinf。大鼠灌服络合制剂和原粉后的Vz无显著性差异。络合制剂的t1/2和MRTlast均小于多西环素原粉，表明络合制剂在体内的滞留时间短于多西环素原粉，因此，可判定络合制剂可缩短休药期。

3 讨论与结论

血浆、血清、尿液等生物样品在分析过程中，易发生待分析物质的损失和信号波动，尤其在质谱检测时，样品中的内、外源性物质会影响分析物的离子化，使质谱响应强度降低或增加，即产生基质效应。血浆样品中的磷脂、蛋白以及盐类属于内源性物质，其中磷脂对质谱结果影响最大，可在较大程度上抑制质谱响应且难以去除[9]。蛋白沉淀( Protein precipitation, PPT )是较简单快速的方法，常用的试剂包括有机溶剂、酸、盐和金属离子。有机溶剂是应用最广泛的蛋白沉淀剂，它能降低介电常数，促进蛋白间的静电作用，导致蛋白聚沉[10]。研究表明，常用的有机溶剂中，乙腈的沉淀效果最佳，与血浆比例为4∶1时，蛋白沉淀率可高达98.5 %，且种属间无明显差异[11]。如果分析物是可电离的，流动相的pH值会对分离物的保留度、选择性和灵敏度产生显著影响[9]。传统的蛋白沉淀-离心技术简单易操作、成本低，但需要人工标记离心管、提取上清，存在操作耗时、难以实现高通量等缺点[12]。有研究指出，使用乙腈沉淀蛋白时会产生较强的离子抑制作用，影响质谱信号强度[9]。除此法之外，还有其他处理技术，能有效减少药动学实验中血浆样品的处理时间[13]。该试验用蛋白沉淀法进行大鼠血浆样品的预处理。

Tmax是达峰时间，指达到峰浓度所需时间。Cmax是达峰浓度，指给药后达到的最高血药浓度。Tmax和Cmax均与灌服给药后药物在体内的吸收快慢和速率有关。AUC是药时曲线下面积，反映到达全身血液循环的药物总量。大鼠灌服络合制剂后的Tmax和Cmax均大于多西环素原粉，AUCall和AUCinf也均大于多西环素原粉的AUCall和AUCinf，表明络合制剂在大鼠体内的吸收速率和吸收程度均大于盐酸多西环素原粉，由此可以推测络合制剂在大鼠体内的生物利用度也高于盐酸多西环素原粉。

大鼠灌服盐酸多西环素原粉和络合制剂后，均出现了“双峰现象”(图4)。这与多西环素在体内进入肝肠循环有关。经胆汁排泄到小肠的多西环素，再一次经过小肠和大肠时，又被重吸收，进入到血液循环，使多西环素的血药浓度升高，导致“双峰现象”[14-16]。

该试验用UPLC/MS/MS检测大鼠血浆中多西环素的浓度，通过药动学研究阐明盐酸多西环素原粉和络合制剂在大鼠体内的ADME过程。试验结果表明，络合制剂比原粉具有更高的吸收和更短的滞留时间，临床应用可适当减少给药剂量或增加给药间隔时间，也可缩短休药期。该试验的研究结果将为络合制剂的临床应用提供理论依据，也将为同类药物的药动学研究提供参考。