低温生境中1株产甲烷微菌BDP-8的筛选分离及其系统发育初步分析

闫非凡， 李 楠， 吕 云， 陈 迪， 朴仁哲, 赵洪颜*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002;2. 珲春市农业农村局，吉林 珲春 133300)

地球表面大约75%处于低温环境[1]。在低温环境中微生物资源非常丰富，这些微生物资源发挥着重要的作用，其中厌氧消化过程是碳源降解重要的一环[2]。产甲烷菌在厌氧消化过程中只占微生物种群的10%左右，但却是关键菌群，因为由其完成的产甲烷过程通常是厌氧消化过程中最重要的限速步骤。因此，挖掘低温厌氧消化过程对菌种资源发挥着举足轻重的作用。

国外对低温产甲烷菌研究较早，自从1992年第1株从湖泊底泥中分离得到嗜冷产甲烷菌Methanococcoidesburtonii后已经获得了8个低温产甲烷菌种，但是多集中在产甲烷八叠球菌，产甲烷鬃毛菌等[3]；国内对低温产甲烷菌的研究刚刚起步，东秀珠等人从若尔盖草原分离获得了1株低温甲基营养型产甲烷菌新种并命名为Methanolobuspsychrophilus[4]，洒威等人在中低温沼气池中分离一株低温产甲烷菌，但是未对菌株进行鉴定[5]；鲁建江等人在越冬的沼气池中分离得到1株低温产甲烷八叠球菌[6]；李军等人在实验室长期运行的UASB反应器中分离得到1株产甲烷粒菌属[7]。而对低温下的产甲烷微菌的分离研究较少，但前期研究证实低温厌氧消化产甲烷阶段产甲烷微菌对菌群的代谢流程起着至关重要的作用[8]。

因此，该研究在延边地区湿地环境中低温下采集样品，采用亨盖特厌氧技术、16S rDNA基因测序技术、扫描电镜等技术对菌株进行分离与系统发育分析，期待为低温厌氧消化过程中产甲烷微菌对沼气发酵的代谢机制和调控技术研究提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

污泥样品采自延边地区的敦化雁鸣湖湿地(敦化5和40 cm的污泥(DH5、DH40)、珲春湿地5、25、40 cm(HC5、HC25、HC40)的污泥样品，样品放在-20 ℃冰箱储存。

1.1.2 培养基和培养条件

富集培养基配制方法为：培养基具体成分和含量见表1，2。调节pH值为6.8～7.0。用无菌注射器接菌，接种量为10%(V/V)。接种后补加混合气体，摇匀后用熔蜡消毒器熔蜡封口，置于15 ℃低温培养箱富集培养[4]。

1.2 方法

1.2.1 产甲烷微菌的富集培养及分离纯化

样品的富集培养和分离纯化使用上海跃进YQX-1型厌氧培养箱。培养的气体为N2∶H2∶CO2=85%∶10%∶5%和99.999%的高纯N2，气瓶减压阀输出压力为0～0.25 MPa，粑粒除氧催化剂和干燥剂除氧。采集的污泥样品，加入到产甲烷微菌的专用培养基中15 ℃低温培养7 d，第1次富集接种量为10%，取菌液第2次富集，接种量为10%，按照同样方法多次富集，通过甲烷含量指标监测富集情况。采用Hungate滚管法进行分离纯化[6]。

表1 产甲烷菌的富集、分离培养基

1.2.2 低温产甲烷微菌菌株筛选

纯化后的产甲烷微菌，将产甲烷微菌株接种到pH值为7.0，产甲烷液体培养基中，在5、10、15、20、30 ℃厌氧培养箱中培养10 d，利用气相色谱测定甲烷含量，通过产气情况筛选菌株。

1.2.3 菌株形态学观察及生理生化试验

1) 菌株生长曲线测定：用紫外可见分光光度计(UV-7502PC)在波长600 nm测定菌液的吸光度OD600。

2) 菌体形态学观察：取对数生长期样品，革兰氏染色后采用Olympus体式显微镜观察菌株的菌落形态；采用对数生长期的样品，干燥、固定后采用扫描电镜HITACHI S-4800观察并拍照。

3) 最适温度、pH值、NaCl浓度生长试验：在液体培养基中添加5%的菌株，厌氧培养箱中恒温培养10 d，气相色谱测定甲烷产量。

4) 生长底物测定：甲醇、甲酸、H2/CO2(80∶20)为单一碳源，加入到灭菌后的产甲烷微菌培养基中，pH值7.0，培养温度15 ℃，培养10 d测定产甲烷含量[9]。

1.2.4 产甲烷菌16S rRNA基因的扩增、测序鉴定及系统发育分析

DNA的提取参照赵洪颜等的方法[10]。16S rRNA基因的扩增选用上海生工股份有限公司用HAP法合成的引物：引物Arch519F的序列为5’-CAGCCGCCGCGGTAA-3’，引物Arch915R的序列为5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’。PCR方法参照[11]。经上海生工测序公司测定后，将16 S rRNA基因的测序结果与NCBI数据库进行Blast比对分析，用Mega 6进行bootstrap分析，重复1 000次，Neighbor-Joining法构建系统发育树。

表2 产甲烷菌富集、分离培养基中的微量元素和维生素溶液

2 结果与分析

2.1 产甲烷微菌的富集培养及筛选

图1为富集培养转接第7代菌液1～10 d的OD600值。由图可知，富集菌液的OD600都在6 d达到最大值，之后稍有降低，敦化40 cm的富集菌液在6 d的OD600最大，说明DH40的产甲烷菌在所有富集菌液样品中生长能力最强。并且可以看出，通过对各样品7代的富集转接，菌种得到驯化，适应该试验所设的培养温度和其他条件，可以进行下一步的分离试验。此外，HC5、HC25、HC40、DH5、DH40的OD600值分别为0.67、0.636、0.605、0.655和0.651，菌液的OD600值均处在0.6～0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期。说明当产甲烷菌生长至10 d时，培养基中菌群的生长繁殖已达到稳定状态，可以进行下一代富集培养。

图1 产甲烷菌富集菌液的OD600值

2.2 产甲烷微菌的分离纯化及生理生化特征

显微镜下观察和扫描电镜照片见图2，3。由图可知，15 ℃下培养10 d长出的菌落为圆形，规则，边缘完整，表面光滑，不透明，呈现乳白色，直径约0.6 μm，长1.5～2 μm，革兰氏染色为阴性，极端严格厌氧，杆状。

图2 菌落形态和革兰氏染色照片 图3 产甲烷微菌分离菌株扫描电镜照片Fig.2 Colony morphology and gram staining Fig.3 Scanning electron micrograph of isolated methanogen strain

BDP-8菌株在pH值为4～9时均能生长，生长最适pH值为7；BDP-8菌株在5～30 ℃均能生长，最适温度为15 ℃；BDP-8菌株在0～0.6 mol/L NaCl浓度下均能生长，而高于0.6 mol/L NaCl浓度时，产甲烷停止，说明最适NaCl浓度为0～0.4 mol/L(图4)。底物实验证实，BDP-8菌株接种碳源底物后，只能利用H2/CO2(80:20) 混合气体，不能利用甲醇、甲酸(表3)。BDP-8菌株生理生化特征(表3)，BDP-8菌株的最适生长温度、pH值、NaCl浓度、生长底物等与目前已报道的产甲烷微菌株非常相似；系统发育的结果进一步证实了此结果。

图4 不同pH值、温度、NaCl浓度下甲烷含量

表3 BDP-8菌株与其它产甲烷微菌属菌株主要生理生化特征比较

2.3 菌株16S rDNA基因测序鉴定

从富集菌液中分离出1株产甲烷菌命名为BDP-8，图5为BDP-8菌株16S rRNA gene的同源性结构系统发育树，BDP-8菌株与Methanolacinia属的3个菌株16S rDNA基因序列相似性为100%，通过NCBI上BLAST BDP-8菌株可为Methanolaciniapetroleariastrain，属于Methanomicrobia；Methanomicrobiales；Methanomicrobiaceae；Methanolacinia。

注：BDP-8为分离菌株的编号；属种前的序号为GenBank登录号；分支节点上的数字代表在1 000次构树过程中的自展值；标尺代表序列差异度为1%

图5 BDP-8菌株16S rDNA gene的系统发育分析

Fig.5 16S rDNA gene phylogenetic analysis of BDP-8 strain

3 讨论与结论

利用厌氧消化技术不仅可以处理废弃物资源而且还可以生产清洁能源，是一项一举双得的技术，但是在寒冷地区受温度的影响无法大规模的产业化，主要原因是低温限制了产甲烷微生物的代谢，影响了产甲烷菌的活性，所以，如何挖掘低温下的微生物资源，从本质上提高产甲烷菌的活性至关重要。因此，该试验从延边地区低温生境中筛选到优良的微生物菌株，对于解析低温下沼气发酵的代谢途径及提高沼气发酵系统的产甲烷效能具有重要意义。在延边地区敦化、珲春不同深度的湖底底泥中分离出1株BDP-8菌株，此菌株生长能力最强，低温的耐受性最好；该菌株最适合的生长温度为15 ℃、pH值为7.0、NaCl浓度为0～0.4 mol/L; 该菌株只能利用H2/CO2(80∶20) 混合气体。16S rDNA gene的系统发育分析鉴定为产甲烷微菌。