热带芳香观赏兰花香花毛兰的组培快繁技术①

席会鹏 葛 奇 李佳蔚

(中国科学院西双版纳热带植物园 云南勐腊666303)

热带兰花引种栽培始于18 世纪，目前已广泛应用于盆花、切花、配餐花与香料等方面［1-2］。中国云南与海南等省份是热带兰花重要的产地，其中蝴蝶兰及大花惠兰系列已成为非常重要的观赏花卉品种［3-5］。香气是构成兰花观赏价值的重要因素，但目前栽培应用的热带兰花品种多不具有香味，多以花色繁多、花朵硕大、花形奇特及花期长为特点［6-7］。因此，培育芳香型品种已成为热带兰花育种的趋势之一。

香花毛兰（Eria javanica）主产于亚洲热带地区，我国多见于云南南部，花期8～10月，花多数，生于长达50 cm 花序轴上，花色白，香气清新，开花时的气质符合中国传统对于兰花“色清”“气清”的审美追求，具有重要的观赏栽培价值，是一个正待开发的芳香型兰花种。然而，香花毛兰植株生长周期长，无性繁殖困难，传统的分株繁殖的繁殖系数极低。人工有性繁殖在自然状态下也难以萌发，因此传统繁殖技术难以大量繁殖。并且，野生香花毛兰主要生于海拔300～1 000 m的林中，多为附生或半附生，由于生存环境的特殊性，全球气候变化与人类活动干扰导致野生附生兰花已急剧减少［8-11］。鉴于香花毛兰的观赏价值与扩繁需求，及严峻的野外资源现状，通过植株组织培养建立香花毛兰繁殖体系迫在眉睫，进而系统化、高效化、快速化繁殖，不受季节与气候等自然因素限制的条件下，短期内获得大量植株，推进该物种的开发利用与保护。

目前，组织快繁已对多种兰花进行大规模的克隆繁殖，不仅减轻了对野生兰花植物采集压力，而且可以获得大量优良种苗。组织培养的研究重点在于优化培养条件，其中培养基成分的优化方面，关注点集中到基本培养基的选择［12-14］，激素配比［15-16］及不同有机成分的添加［17］。

对于毛兰属植物的组培快繁，现有研究主要是针对足茎毛兰。王莲辉等［18］在足茎毛兰的组培快繁研究中，以原球茎为外植体探究不同种类的有机添加物对其的影响，并对适宜足茎毛兰增殖生长和生根生长的培养基进行探索。其结果表明：在足茎毛兰的组培快繁研究中，有机添加物10%的椰子汁对原球茎的诱导有极显著影响；激素组合6-BA 和NAA 及配比10∶1 时对芽的诱导和增殖起明显的促进作用；一定浓度的IBA对足茎毛兰的壮苗生根起关键性作用；栽培基质的选择极大地影响足茎毛兰的移栽成活率。

对于香花毛兰的组培，仍然缺少报道。本研究对香花毛兰丛生芽的增殖、生根壮苗过程进行了重点研究，通过对最优基本培养基、最佳有机添加物、激素浓度配比及N、P、K元素等影响因素进行研究，探索并优化香花毛兰组培快繁技术，以期为香花毛兰的开发利用与保护提供理论与实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香花毛兰的种子采自中国科学院西双版纳热带植物园种苗组兰科植物资源圃中，试验在中国科学院西双版纳热带植物园种苗组组培室中进行。以八九成熟的自交蒴果作为外植体进行无菌播种，播种培养基为MS＋香蕉50 g/L＋土豆50 g/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂粉4.0 g/L＋AC1.0 g/L。并在该播种培养基上获得无菌苗。选取无污染、生长健壮、长势一致的无菌苗，切除根、侧芽及长势较弱的叶片后，作为各处理的试验材料。

1.2 方法

1.2.1 不同基本培养基对香花毛兰丛生芽增殖与壮苗生根的影响

用香花毛兰无菌苗作为试验材料，每瓶10株，每个处理各10 瓶，重复3 次。采用KC、VW、Mi‐tra、MS、全半量1/2MS、部分半量1/2MS 6 种的不同基本培养基，培养100 d 后测量并统计新根数、新芽数、株高、根长、根粗。

1.2.2 不同有机添加物对香花毛兰丛生芽增殖与壮苗生根的影响

以Mitra培养基作为基本培养基，用香花毛兰无菌苗作为试验材料，每瓶10 株，每个处理各10瓶，重复3次。采用10%香蕉、10%洋芋、10%椰子汁3 种不同的有机添加物，培养100 d 后测量并统计新根数、新芽数、株高、根长、根粗。

1.2.3 6-BA 与NAA 的不同浓度配比对香花毛兰丛生芽增殖培养的影响

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋琼脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L为基本培养基，比较6-BA和NAA 2 种外源激素的不同浓度配比对香花毛兰无菌苗增殖生长产生的影响，每种外源激素各设0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 4 个浓度梯度，并以空白作对照。将处理好的无菌苗接种至不同培养基中，每瓶10株，每个处理各10瓶，重复3次，培养120 d 后测量并统计新根数、新芽数、株高、根长、根粗。

1.2.4 6-BA 与IBA 的不同浓度配比对香花毛兰壮苗生根培养的影响

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋琼脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L为基本培养基，比较6-BA和IBA 2 种外源激素的不同浓度配比对香花毛兰无菌苗生根生长产生的影响，6-BA 设有0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4个浓度梯度，IBA设有0.02、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/L 5 个浓度梯度，并以空白作对照。将处理好的无菌苗接种至不同培养基中，每瓶10 株，每个处理各10 瓶，重复3 次，培养120 d后测量、统计新根数、新芽数、株高、茎粗、根长、根粗。

1.2.5 改良Mitra基本培养基对香花毛兰壮苗生根的影响

以Mitra培养基为基本培养基，单独加倍培养基中N、P、K元素含量，比较其对香花毛兰生长产生的影响。将处理好的无菌苗接种至不同培养基中，每瓶10 株，每个处理各10 瓶，重复3 次，培养100 d 后测量、统计新根数、新芽数、株高、茎粗、根长、根粗。

1.2.6 炼苗移栽

移栽前首先要将组培瓶移入炼苗室内，每天早10 点至下午17 点用60%遮阴度的遮阳网遮阳，持续30 d；炼苗后将苗取出，洗净根上的培养基，用多菌灵3 g/L＋硫磺链霉素1 g/L的溶液浸泡消毒10 min，晾干，移栽入组培盘内。

1.2.7 培养方式及培养条件

所有培养瓶均用650 mL兰花瓶，增殖培养基每瓶分装75 mL，壮苗生根培养基每瓶分装100 mL，pH均为5.8。材料均置于（25±2）℃和18 00～2 500 lx光照条件下培养，每天均需用日光灯照明12 h。

1.2.8 数据处理

运用SPSS 19.0 进行方差分析，其中方差分析方法采用的是单因素方差分析和双因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，并采用标记字母法将多重比较的结果清楚地表达出来。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对香花毛兰丛生芽增殖与壮苗生根的影响

对比不同基本培养基对香花毛兰丛生芽根数、根长、根粗、芽数及株高指标的影响，发现Mitra培养基中生根数量最多，所发新根最长、最粗，且与其余5组之间均存在显著性差异；1/2 MS全半量培养基中所发新芽显著多于其余各组，但株高与最佳MS 培养基不存在显著性差异；MS 培养基中植株株高与KC 培养基存在显著性差异，与其余组不存在显著性差异（图1）。但从生长表现来看，KC 培养基和VW 培养基中生长的无菌苗均存在不同程度的褐化现象；MS培养基、1/2 MS部分半量培养基中生长的无菌苗根部均存在不同程度的变异现象。因此，香花毛兰增殖基本培养基为1/2MS全半量培养基；壮苗生根基本培养基为Mitra培养基。

2.2 不同有机添加物对香花毛兰丛生芽增殖与壮苗生根的影响

对比不同有机添加物对香花毛兰丛生芽根数、根长、根粗、芽数及株高项指标的影响，发现加入香蕉、椰子汁以及没有加入任何添加物的培养基中无菌苗所发新根的根数、根长、根粗显著高于加入土豆的培养基，加入椰子汁的培养基中其3项指标均显著高于加入香蕉及无添加物的培养基；加入椰子汁的芽数显著高于其余3种处理，加入香蕉与无添加培养基之间的芽数不存在显著差异，均高于加入洋芋的芽数；加入椰子汁的株高显著高于其余3 种处理。因此，添加10%椰子汁的培养基均有利于香花毛兰的增殖与壮苗生根（图2）。

2.3 6-BA 与NAA 的不同浓度配比对香花毛兰丛生芽增殖培养的影响

由表1可知，在香花毛兰丛生芽增殖培养过程中，6-BA的独立作用对根数、根长、芽数、株高4个因素的影响存在极显著差异，对根粗的影响存在显著性差异，对茎粗的影响不存在显著性差异；NAA的独立作用对香花毛兰增殖培养中根数、根长、根粗、芽数、株高六个因素的影响存在极显著差异；6-BA与NAA的交互作用对香花毛兰增殖培养中对根数影响不存在显著性差异，对根长、根粗、芽数、株高四个因素的影响存在极显著差异。

6-BA 浓度为0.1 mg/L 与NAA 浓度为0.5 mg/L、6-BA 浓度为0.2 mg/L 与NAA 浓度为1.0 mg/L 、6-BA浓度为0.5 mg/L与NAA浓度为0.5 mg/L、6-BA浓度为0.5 mg/L 与NAA 浓度为1.0 mg/L 四组浓度配比对根数的影响显著优于其余各组，其中6-BA 浓度为0.2 mg/L 与NAA 浓度为1.0 mg/L 时生根数量最多（图3a、3b）。当6-BA 浓度为0.2 mg/L 与NAA 浓度为1.0 mg/L、6-BA 浓度为0.5 mg/L 与NAA 浓度为1.0 mg/L、6-BA 浓度为1.0 mg/L 与NAA 浓度为2.0 mg/L、6-BA浓度为2.0 mg/L 与NAA浓度为2.0 mg/L时对根粗的影响优于其余各浓度配比（图3c、3d）。当NAA 浓度一定时，6-BA 浓度对根长的影响会随6-BA 浓度的增大而增强，到一定峰值后又会随着其浓度的增大而减弱；当NAA浓度为0.1 mg/L与6-BA 浓度为0.5 mg/L 或1.0 mg/L 时显著优于其余各组（图3e，3f）。在香花毛兰丛生芽增殖过程培养中当NAA 浓度为1.0 mg/L 时，6-BA 浓度为0.5 mg/L对芽数的影响最大（图3g、3h）。株高的大小会随6-BA 与NAA 浓度配比的大小变化而变化，并在6-BA 浓度为0.5 mg/L、NAA 浓度为0.1 mg/L 时达到最大，6-BA 浓度为0.2 mg/L、NAA 浓度为1.0 mg/L 时次之（图3i、3j）。因此，6-BA 浓度为0.5 mg/L、NAA 浓度为1.0 mg/L 时为香花毛兰丛生芽增殖最佳激素组合。

表1 6-BA与NAA的不同浓度配比对香花毛兰丛生芽增殖培养的双因素方差分析

2.4 6-BA 与IBA的不同浓度配比对香花毛兰壮苗生根培养的影响

由表2可知，6-BA的独立作用在香花毛兰壮苗生根培养中，对根数、根粗、芽数三个因素的影响均存在极显著差异；对根长、株高因素的影响均不存在显著性差异。IBA 的独立作用在香花毛兰壮苗生根培养中，对根数、芽数因素的影响均不存在显著性差异；对株高的影响存在极显著差异；对根长、根粗两个因素的影响均存在显著性差异。6-BA 与IBA 的交互作用在香花毛兰壮苗生根培养中，对根长的影响不存在显著性差异；对根数、根粗三个因素的影响存在显著性差异；对芽数、株高两个因素的影响存在极显著差异。

表2 6-BA与IBA的不同浓度配比对香花毛兰壮苗生根培养的双因素方差分析

在香花毛兰生根培养中，当6-BA 浓度为0 与IBA 浓度为0.6 mg/L、6-BA 浓度为0.1 mg/L 与IBA浓度为0.02 mg/L、6-BA 浓度为0.1 mg/L 与IBA 浓度为0.2 mg/L 时，生根数量与6-BA 浓度为0、IBA浓度为0.4 mg/L 时有一定差距，但是生根数量均较多，且与其余各浓度配比相比存在显著的优势（图4a、4b）。当6-BA 浓度为0、IBA 浓度为0.6 mg/L 时，所发新根根长最长，且大于空白对照组，其余各浓度配比根长或等于或小于空白对照组，作用效果均劣于6-BA（图4c、4d）。当6-BA 浓度为0、IBA 浓度为0.6 mg/L 时，所发新根最粗壮、结实，并显著优于其余各浓度配比（图4e、4f）。当6-BA浓度为0时，芽数的大小随IBA浓度的变化而变化，并在浓度为0.4 mg/L 时取得最值，浓度为0.6 mg/L 时次之，浓度为1.0 mg/L 再次之（图4g、4h）。当6-BA 浓 度为0.1 mg/L、IBA 浓 度 为0.02 mg/L 时，株高取得最大值，但与6-BA 浓度为0、IBA 浓度为0.4 mg/L 时、6-BA 浓度为0.5 mg/L、IBA 浓 度 为0.6 mg/L 时、6-BA 浓 度 为1.0 mg/L、IBA 浓度为0.6 mg/L 时无显著差异（图4i、4j）。因此，IBA 浓度为0.4 mg/L 时为香花毛兰壮苗生根最佳激素组合。

2.5 改良Mitra基本培养基对香花毛兰壮苗生根的影响

改变Mitra 培养基中N、P、K 元素含量（含量加倍），发现对照组（Mitra）会使叶色泛黄的问题稍微得到缓解，原因可能是经过转接无菌苗的生长发育状况会发生一定的改观；加入一定量的N元素能够明显改善Mitra基本培养基中香花毛兰叶色普遍泛黄的问题，叶片变得浓绿有光泽，使幼苗生长更加健壮；加入一定量的P、K 元素不会使叶色发生明显的改变（表3，图5）。因此，改良Mitra 基本培养基时应加入一定量的N 元素以利于其生长。

3 讨论与结论

关于香花毛兰组培快繁的研究目前仍为缺乏［18］。本研究探讨其丛生芽的增值，诱导壮苗生根过程中最佳培养基配比方案，实验结果发现，相较KC、VW、MS、与部分半量1/2 MS，全半量1/2 MS 培养基为最适宜香花毛兰丛生芽增殖基本培养基；Mitra 培养基为最适宜香花毛兰壮苗生根的基本培养基；并且对比该培养基添加了香蕉、洋芋后，添加椰子汁的培养基更有利于其生长，这与王莲辉等［18］研究足茎毛兰组培快繁过程中获得结果一致。

控制激素浓度的实验发现，在香花毛兰增殖培养过程中6-BA 和NAA 都具有一定的促进作用，但6-BA 对其增殖生长的影响大于NAA 对其增殖生长的影响，并得出当6-BA 浓度为0.5 mg/L、NAA 浓度为1.0 mg/L 时效果最好，且实际操作过程中也发现当6-BA 浓度为0.5 mg/L、NAA 浓度为1.0 mg/L时幼苗所发侧芽最多、生长最健壮。因此，最适合香花毛兰丛生芽增殖生长的激素浓度配比为：6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L。在香花毛兰的壮苗生根培养中，IBA 对根数、根长、根粗的影响较为显著，起主导作用，6-BA 对其影响较小，起辅助作用，加入6-BA 并没有对香花毛兰的生根生长起到显著性作用。并得出当6-BA 浓度为0 mg/L、IBA浓度为0.4 mg/L 时，幼苗生长状况最好。与实际操作过程中所得结果一致。

最适宜香花毛兰丛生芽增殖的培养基配方为：1/2 MS 全半量＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 1.0 mg/L＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋琼脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；最适宜香花毛兰壮苗生根的培养基配方为：Mitra＋NH4NO30.83 g/L＋IBA 0.4 mg/L ＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋琼脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；改良培养基中加入N元素更有利于香花毛兰叶色由黄绿转变为浓绿。

表3 改良Mitra基本培养基对香花毛兰壮苗生根的影响

本研究中快繁体系还存在有待改进之处，如在基本培养基的筛选试验过程中，发现MS、全半量1/2 MS、部分半量1/2 MS培养基中幼苗根部出现绕颈的“自杀式”生长，通过比较正常生长的Mitra 培养基中的元素含量发现三者的元素含量普遍偏高，所以其根部的这种生长现象可能与培养基中的元素含量有关。在有机添加物的试验过程中，仅简单考虑了相同量不同有机添加物之间的差异，而没有考虑几种有机添加物共同作用对香花毛兰生长的影响。