不同化学型互叶白千层优良单株选择及种质资源分子鉴别①

覃子海 唐庆兰 梁忠云 肖玉菲 张 烨 张晓宁 刘海龙

(广西壮族自治区林业科学研究院/国家林业局中南速生材繁育实验室/广西优良用材林资源培育重点实验室 广西南宁530002)

互叶白千层是桃金娘科（Myrlaceaca）白千层属（Melaleuca）常绿灌木或小乔木树种，原产于澳大利亚东部的昆士兰州和新南威尔士的北部。由于互叶白千层枝叶中含有α-松油烯，桉叶素，γ-松油烯，4-松油醇等多种挥发性成分，长期以来作为香料植物在澳洲广为种植［1-2］。20世纪90年代初，由于认识到互叶白千层的重要价值，我国开始规模引种互叶白千层［3］。

广西林科院1998 年引进了白千层优良种子并进行引种试验，后续研发了白千层组培无性繁殖技术［4-5］，并针对白千层栽培种过程中的水份［6-8］、养分需求［9-12］以及采收方式等进行了全面的研究，为白千层的规范化推广种植提供了充分的技术指导。对从澳大利亚引进的白千层芳香油树种天然种子进行繁育，并对生长期为18 个月的白千层枝叶进行含油量测定，分析不同种源、家系白千层芳香油组分及含量，结果发现互叶白千层天然家系的单株各成分变异较大，同一家系不同植株的芳香油的主要成分含量差别也很大。互叶白千层天然林种子可分为4-松油醇型，1，8-桉叶素型和中间型3种类型［13-15］。其中前两种类型更具开发价值。4-松油醇型白千层选优工作已有福建、广西、广东等地开展。福建林科院吴丽君等［16］以茶树油国际标准（ISO4730-1996）为基准，以枝叶量、含油率、精油中4-松油醇、1，8-桉叶素含量为评价指标，复选出了14 株高精油优良单株，1，8-桉叶素型研究较少。随着白千层精油（茶树油）的研究与应用日趋活跃，对茶树油的质量要求也越来越高，根据需要选择上述两种化学型的互叶白千层优株已迫在眉睫［17］。本研究拟以此为目标，选择出标准更高的优株，以确保茶树精油的品质和产量，并通过组培技术实现“有性起源，无性利用”，使互叶白千层种植加工项目经济效益最大化。

1 材料与方法

1.1 材料

广西林科院948项目引种后在广西区内营造了多个实生苗林份，分布在玉林市玉州区仁东镇、仁厚镇，以及钦州市钦州林科所。实生林份种植树龄4 年，株行距0.8 m×0.8 m，种植面积7 hm2，种植地土壤为薄层黄红壤，肥力较低，周边为桉树林。种植后每年追肥2 次，分别在4～5 月和7～8 月实施。追肥时在每株树冠滴水线一侧偏上（距离幼树树根20 cm 以上）开深15 cm、长25 cm、底宽10 cm 施肥沟，施后立即盖土，盖土厚度要高出沟面，每株施复合肥（养分氮磷钾总含量35%）100 g。每年采用割灌抚育或除草剂除草2次。

1.2 方法

1.2.1 优树选择方法

1.2.1.1 初选

通过目测，在白千层林中选取树冠较大，枝叶浓密的单株。采集目测所选单株的叶子，用手揉搓后闻其味道，4-松油醇香味浓郁并且无桉叶素的特殊凉味植株作为4-松油醇型初选优株，桉叶素的特殊凉味浓郁的植株作为1，8-桉叶素型初选优株，分别做好标记。

1.2.1.2 复选

采集标记植株的枝叶（去除大于1 cm 的枝条及枯黄枝叶），用塑料袋包装好，当天运回实验室，称重，测定其含油率和精油成分。精油提取采用水蒸汽蒸馏法，主要成分的含量检测参照国际标准ISO4730 执行。精油中4-松油醇大于38%、1，8-桉叶素小于3%、含油率大于1.0%的植株，确定为4-松油醇型复选优株。精油中1，8-桉叶素含量大于60%、枝叶含油率大于1.5%的植株，确定为1，8-桉叶素型复选优株。

1.2.1.3 决选

对复选株进行平茬处理，并进行抚育。待其萌芽后，取萌芽条，ABT 处理后进行扦插育苗。将成活的扦插苗进行大田种植，株行距0.8 m×0.8 m，测定1 年生植株的树高、地径、枝叶生物量（去除大于1 cm 的枝条及枯黄枝叶），并再次测定枝叶的含油率和精油成分，测定方法同1.2.1.2。单株得油量大于10 g的即决选为优株。

1.2.1.4 主要评价指标增益估算

以复选优株1年生植株的枝叶生物量（去除大于1 cm 的枝条及枯黄枝叶）、含油率、得油量平均值为参照，计算决选优株枝叶生物量、含油率及得油量的增益。

1.2.2 不同生化类型互叶白千层种质资源分子鉴别

1.2.2.1 DNA提取

选取4-松油醇型和1，8-桉叶素型植株共28份，采集试样幼嫩叶片，采集当天或第2 天进行DNA 提取。采用改良CTAB 法提取互叶白千层总DNA。取5 μL DNA，分别利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所提取DNA纯度与浓度。

1.2.2.2 SSR 反应体系与程序

SSR-PCR 反应体系经过比较和优化确定为10 μL，包括Buffer（1×）、dNTPs（200 μmol/L）、Forward primer （0.5 mmol/L）、Reverse Primer（0.5 mmol/L）、模板DNA（5 ng）、Taq 酶（1U）、Mg2+（1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）。其中Mg2+的浓度根据引物信息确定。

SSR 优化程序：94℃预变性4 min，20 个循环（94℃变性30 s，66～56℃梯度降温扩增30 s，每循环降0.5℃，72℃延伸1 min），26 个 循环（94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min），72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 试验数据处理

SSR 扩增产物所得的电泳图谱中的每个谱带均视为1 个引物的结位点。统计谱带时认为电泳迁移率相同的谱带是扩增基因组上的相同DNA片段的产物。选用清晰、重复性好的谱带进行分析，采用人工读带法，按谱带的有或无分别赋值，扩增谱带有时记为“l”，无时记为“0”，得到原始的“0/l”矩阵。并建立引物SSR识别卡。

遗传多样性分析主要计算多态位点百分率并利用物种遗传分析软件POPGEN 对统计的“0/1”数据矩阵进行分析，计算等位基因平均数N1、有效等位基因数N2、基因多样性指数Hs、遗传距离、遗传一致度。

2 结果与分析

2.1 4-松油醇型互叶白千层优良单株选择

经过筛选获得初选优株103株，复选后获得复选优株34 株，再经生物量测定决选优株7 株。初选备选株103株，白千层单株得油率和成分差异较大，得油率在0.88%～2.2%，精油中4-松油醇含量在33.63%～42.70%，1，8-桉叶素含量在0.44%～9.55%。复选优株的得油率及成分含量见表1。

复选的34 株优株，含油率＞1.0%（1.07%～1.83%），精油中1，8-桉叶素含量＜3.0%（0.44%～2.94%）， 4- 松 油 醇 含 量＞38.0% （38.72%～42.70%）。决选的优株7 株，其单株得油量均大于10 g（11.30～26.58 g），含油率为1.00%～1.46%，精油中4-松油醇含量为38.04%～40.27%，1，8-桉叶素含量为1.09%～2.21%。见表2。

2.2 1，8-桉叶素型互叶白千层优良单株选择

初选获得备选株78 株，复选确定复选优株22株，复选优株的得油率及成分含量见表3。

复选的22 株优株，含油率＞1.5%（1.521%～3.329%），精油的特征组分为1，8-桉叶素含量＞60% （63.04%～69.61%），4-松 油醇含量＞1.0%（1.051%～2.528%），α-蒎烯：1%～5%，苧 烯：5%～10%，α-松油醇：6%～15%（表4）。

2.3 互叶白千层SSR引物筛选

经过SSR-体系优化及引物筛选，从SSR 选择性扩增引物组合中筛选出适合互叶白千层的4组扩增条带明晰的引物组合，4组引物组合分别为Em‐bra53、Embra77、Embra203、eSSR0952。引物 见表5。

通过人工读带法，对SSR 扩增产物所得清晰、重复性好的电泳图谱建立“0/1”数据矩阵。利用物种遗传分析软件POPGEN 对统计的“0/1”数据矩阵进行分析，白千层遗传多样性分析，4 对SSR引物共扩增出68 条谱带，其中多态性谱带64 条，多态率为94.12%。遗传一致度为0.303 5～0.897 1；遗传距离为1.007 5～9.412 8，表明白千层28份材料遗传基础广泛，多态性丰富。SSR 的部分扩增图谱如图1所示。

结合精油成分与遗传距离综合分析，在进一步聚类分析中，28 份材料被划分为2 大类，其中16 份（包括14 个桉叶素型、2 个4-松油醇型）为一类，12 份（包括3 桉叶素型、9 个4-松油醇型）为一类。除部分材料外，SSR 标记将14 个桉叶素型与9个4-松油醇型区分开，可作为互叶白千层种质资源鉴别的分子标记。

表1 4-松油醇型互叶白千层复选优株的得油率及其成分含量（%）

表2 决选的4-松油醇型优良单株指标

表3 1，8-桉叶素型互叶白千层复选优株的得油率及其成分含量（%）

表4 实测1，8-桉叶素型选择白千层单株精油成分含量（%）

3 讨论与结论

优良单株选择的理论基础是种内个体间普遍存在着变异。相关研究表明，互叶白千层种源间、种源内、家系间、家系内的单株个体间茶树油的产量和质量均存在较大差异。因此，在实生苗优良群体中进行优良单株的筛选是可行的。

初选通过目测和鼻嗅的方法，对生物量和精油成分进行初步筛选，确定备选株，可以减少后续筛选工作的工作量。复选以含油率、精油中4-松油醇、1，8-桉叶素含量做为选择指标，其中4-松油醇型优良单株要求含油率＞1.0%，精油中4-松油醇含量＞38%，1，8-桉叶素含量＜3%，这些指标高于最新的茶树油国际标准［ISO4730：2017（E）］，也高于吴丽君等［16］的选优标准（其入选14 株复选株中有12 株精油中1，8-桉叶素含量高于3%），同时高于梁忠云等［17］的选优标准（其精油中4-松油醇含量35%～40%，1，8-桉叶素含量为3.99%）。

表5 引物及引物序列

1，8-桉叶素型互叶白千层优株选择时，复选以含油率、精油中1，8-桉叶素含量做为选择指标，要求含油率＞1.5%，精油中1，8-桉叶素含量＞60%，这些选择指标是基于广西地方标准《互叶白千层（精） 油，1，8-桉叶素型》（DB 45/T 889-2012）和实际测定。与DB 45/T 889-2012 制定的标准各成分相比，本标准选育的植株经过加工的精油成分含量范围还是差异较大，本研究选择的单株加工后的精油更适合工业应用。

决选的优株是在复选优株的基础上对生物量、得油量进行筛选后得到的，得油量做为终极的判定指标。决选优株和复选优株相比，枝叶生物量、得油量均有较大增益，分别为29.5%～110.8% 和46.6%～237.9%。经过决选后的优良单株的精油产量和质量都优于国内的优良单株。

无性系选优是良种选育的重要方法之一，经无性系选优并测定的优株，可通过无性繁殖实现规模利用。本研究中编号34、113的无性系是组培快繁的主要目标植株，同时拟引进福建H38等优良无性系推广种植，以增加无性系数量，丰富白千层人工林遗传多样性。

本研究利用4对SSR引物对28份实验材料进行了初步扩增分析，共扩增出68 条谱带，其中多态性谱带64 条，多态率为94.12%。遗传一致度为0.303 5～0.897 1；遗传距离为1.007 5～9.412 8，表明28 份材料遗传基础广泛，多态性丰富。其中SSR 标记将14 个桉叶素型与9 个4-松油醇型区分开，本研究结果为互叶白千层种质资源分子鉴别奠定了研究基础。