PCR检测技术在真菌性角膜炎快速诊断中的应用*

王 俊,王 宇,2,彭柿杰,冯 涛,唐卫东

1.攀枝花学院附属医院检验科,四川攀枝花 617000；2.攀枝花学院医学院,四川攀枝花 617000

真菌性角膜炎是由各种真菌引起的角膜病变,早期诊断困难,严重者可致盲[1]。快速诊断真菌性角膜炎有助于临床的诊治,以及患者眼球和视力的恢复。本研究通过比较革兰染色镜检、真菌培养和聚合酶链反应(PCR)3种检测方法在诊断真菌性角膜炎中的优缺点,探讨PCR检测技术在真菌性角膜炎的快速诊断中的应用价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集攀枝花学院附属医院2016年1月至2018年12月收治的502例疑似感染性角膜炎的患者为研究对象,其中男320例,女182例；年龄1～87岁,平均(53.36±18.56)岁。

1.2仪器与试剂 革兰染液和乳酸酚棉兰染液均购自珠海贝索生物技术有限公司；沙保罗平板购自郑州安图生物有限公司；实时荧光定量PCR仪、电泳仪和凝胶电泳成像系统购自美国伯乐生命医学产品有限公司；核酸提取试剂盒购自广东凯普生物科技股份有限公司；PCR引物的合成和测序均由苏州金唯智公司完成。

1.3方法 眼科医生根据患者临床症状和病史,进一步做裂隙灯和激光共焦显微镜检查,对出现角膜溃疡患者刮取角膜分泌物分别做革兰染色镜检、真菌培养和PCR检测。

1.3.1革兰染色镜检 由眼科医生无菌操作刮取患者角膜病变部位组织,制成涂片,自然干燥后火焰固定,然后进行革兰染色,最后采用油镜进行镜检。

1.3.2真菌培养 取涂片的同时,将角膜分泌物分别接种于两块沙保罗平板,分别放置于28 ℃和35 ℃培养箱中培养7 d,每天观察,长出可疑菌落进一步做乳酸酚棉兰染色鉴定。

1.3.3PCR检测 (1) PCR引物设计,参考文献[2],选择内转录间隔区1 (ITS1)和内转录间隔区4(ITS4)为真菌通用型引物,分别为5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3′和5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。因为菌种的差异,ITS1和ITS4可扩增出500～600 bp不等的片段。(2)真菌DNA的提取,将清洗液1.0 mL加入标本中,振荡；将振荡均匀的液体转至1.5 mL离心管,以13 000 r/min转速离心5 min,弃去上清液；再次加入1.0 mL清洗液,振荡重悬,以13 000 r/min转速离心5 min,弃去上清液；将核酸提取液100 μL加入沉淀,重悬,将提取固形物1管加入后,高速涡旋振荡5 min后,瞬时离心；然后置95 ℃干浴2 min,马上冰浴5 min,立刻以13 000 r/min离心5 min,上清液即为PCR反应的模板(保存温度—20 ℃)。(3) PCR反应,用上述提取的真菌DNA为模板,用真菌通用引物扩增相应的片段。反应体系:25 μL Mix溶液、1.5 μL上/下游引物、1 μL模板DNA,双蒸馏水加至50 μL。反应条件:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环；72 ℃延伸10 min。取扩增产物5 μL做1%琼脂糖凝胶电泳,观察是否有特异性扩增条带。(4)PCR扩增产物分析,电泳后,如果有目标带出现,则纯化PCR产物,外送测序。电泳出现阳性结果,则登录Gen-Bank,使用 Blast对测序结果进行同源性比对,进而鉴定菌株。如果是同一属,序列同源性大于97%；如果是同一种则大于99%；如果是阴性结果则不会出现特异性扩增条带。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计分析。计数资料以例数或百分率表示,多组间比较采用χ2检验,多组间的两组比较采用Fisher确切概率法比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1革兰染色镜检结果 502份角膜分泌物革兰染色镜检检出阳性28例,检出率为5.6%。

2.2真菌培养结果 502份角膜分泌物真菌培养检出阳性24例,检出率为4.8%,检出真菌种属见表1。

表1 PCR检测和真菌培养结果[n(%)]

2.3PCR检测结果 用ITS1和ITS4对502例疑似患者的角膜分泌物标本直接进行PCR检测,扩增结果见图1。扩增出的目的片段约500 bp。共检出阳性30例,检出率5.9%,检出真菌种属见表1。PCR检测结果为阳性的30例患者中，23例为农民(76.7%),7例为非农民(23.3%)；15例为男性(50.0%),15例为女性(50.0%)。PCR检测结果为阳性的30例患者中，革兰染色镜检28例阳性,真菌培养24例阳性。

2.43种方法检测结果的比较 502份角膜分泌物中,PCR检测的检出率最高,为5.9%(30/502)；革兰染色镜检检出率次之,为5.6%(28/502)；真菌培养检出率最低,为4.8%(24/502)。但三者比较,差异无统计学意义(χ2=0.722,P=0.697)。

注：M为DNA标记物；4、11为阴性结果；1～3、5～10、12、13为阳性结果。

图1 PCR扩增结果

3 讨 论

PCR检测出的菌株中,镰刀菌属最多,为70.0%,曲霉菌属次之,为10.0%,与某些国内报道的镰刀菌属占63.2%,曲霉菌属占14.1%等数据接近[3-6]。30例PCR检测结果阳性的病例中:23例为农民,占检出人群的76.7%；男女患者各15例,各占50.0%,与胡卫萍等[7]报道的男性患者占67%和女性患者占33%略有不同。我国大于60%的真菌性角膜炎的发生与角膜植物外伤史密切相关[8]。自然环境中广泛存在镰刀菌属和曲霉菌属等植物致病性真菌[9],农民由于频繁地从事农业生产活动,角膜容易被植物叶子及枝条等划伤，引起真菌性角膜炎可能性更大[10]。

近年来,真菌性角膜炎感染发生率增加了数倍,呈明显上升趋势[11],由此导致角膜穿孔的风险也比细菌性角膜炎高出5～6倍[12],同时也增加了患者手术风险[13-15],及早诊断和治疗显得尤为关键。但是目前,真菌性角膜炎的早期诊断面临重重窘境:首先,真菌性角膜炎早期临床表现不具有典型特征,容易与细菌或阿米巴等微生物引起的角膜炎混淆,导致出现误诊。其次,传统的实验室检查,如革兰染色镜检和真菌培养难以做到既快速又准确。革兰染色镜检简单、快速[16-17],可多部位多次取材,提高检出率,缺点是不能将所见真菌准确鉴定到种属,临床医生只能经验性治疗,容易延误病情。真菌培养物染色后,采用显微镜观察菌丝和孢子仍然是诊断真菌性角膜炎的金标准[18-19],有助于医生合理治疗,但需耗费2～7 d,甚至更长的时间,同时标本受污染的风险较高。

PCR检测技术以准确、快速、特异、敏感和标本用量少等优点受到临床一线工作者的青睐,研究者们也尝试用分子生物的手段对真菌性角膜炎进行快速诊断。本研究中,革兰染色镜检、真菌培养和PCR检测的检出率差异无统计学意义(P>0.05),PCR检测和真菌培养检测的真菌种属比较,差异也无统计学意义(P>0.05),表明PCR检测的检出率及对真菌种属的鉴定能力可与另外两种方法媲美,且PCR检测的优势更加突出:数小时内直接将标本中少量真菌初步鉴定到属或种,大大缩短了检测周转时间(TAT),能尽快给临床医生提供准确诊断的依据和有效治疗的方向,既让患者及时得到最佳的治疗,也为患者节省了医疗费用,同时减少了真菌耐药性的发生。但是,对非致病性DNA的扩增可造成过度诊断[20],不应将PCR检测作为常规诊断真菌性角膜炎的唯一方法,可联合其他方法提高诊断的准确性。本研究中,PCR检测的检出率偏低,可能与医生的取材、患者在入院之前就自行使用各种滴眼液和积累的分析数据量不够大等有密切的关系,具体原因有待进一步探讨。

综上所述，PCR检测、革兰染色镜检和真菌培养3种方法对真菌性角膜炎的检出率无明显差异,但PCR 检测的时效性有明显优势,在快速诊断方面具有广阔前景。