核酸和血清学指标结合，多类型标本联检，提高新型冠状病毒检出率

鲁 彦，居 军，李德红

1.中国人民解放军96604部队医院检验科，甘肃兰州730030；2.甘肃省人民医院检验中心，甘肃兰州 730099

鲁 彦

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传染性极强、主要经飞沫和接触传播、不排除气溶胶和消化道传播可能的急性传染病[1-3]。COVID-19临床特征表现有发热、干咳、乏力，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者可快速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭[1,3-6]。SARS-CoV-2属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。SARS-CoV-2基因组的长度为29 881 nt(GenBank MN988668和MN988669，序列读取存档数据库Bioproject登录号PRJNA601736)。系统发育分析表明，SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒BtCoV/4991(GenBank KP876546)的部分RdRp基因的核苷酸同源性达98.7%[1,7-8]。SARS-CoV-2基因特征与2003 年严重急性呼吸综合征病毒(SARSr-CoV)和2012年的中东呼吸综合征冠状病毒(MERSr-CoV)有明显区别[1]。确诊的患者和无症状隐性感染者是SARS-CoV-2的传染源[3-4,9]。通过流行病学特征、临床特征、影像学特点，以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或基因测序检测呼吸道分泌物、支气管灌洗液、血液或者粪便标本中SARS-CoV-2核酸是确诊SARS-CoV-2的主要依据[4]。测定SARS-CoV-2核酸常用的方法有RT-PCR、基因测序、恒温扩增等，最常用的仍然是RT-PCR。不同品牌RT-PCR试剂检测SARS-CoV-2的灵敏度有区别，不同类型标本检出率不一致，对临床症状明显、影像学特点符合COVID-19，但核酸检测阴性的患者，应增加标本种类、更换试剂品牌验证SARS-CoV-2是否为阳性。鉴于目前核酸检测有一定的漏诊率，建议将核酸检测和血清学检测结合起来、增加检测标本类型，采用不同品牌试剂盒检测，可提高检测的灵敏度，减少漏检率，达到控制传染源的目的。

1 核酸检测在COVID-19诊断和治疗中的意义重大

病毒的分离和培养是SARS-CoV-2检测的金标准。人体感染后96 h左右呼吸道上皮细胞内即可出现SARS-CoV-2，但体外分离培养需要6 d，且病毒的分离和培养对实验室要求较高，需要在P4实验室进行，绝大多数临床实验室达不到要求[10]。因此，病毒培养虽然特异度高，但对于疾病的早发现、早报告、早隔离、早治疗意义不大。RT-PCR是检测SARS-CoV-2核酸最重要的方法。目前，国内批准的PCR试剂盒扩增的靶区分别为SARS-CoV-2基因组中开放读码框1a/b(ORF1ab)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)，见图1[11]。有的试剂盒仅针对ORF1ab靶区(华大生物)，有的试剂盒针对ORF1ab、N基因两个靶区(圣湘、达安基因)，有的试剂盒针对3个靶区(ORF1ab、N和E 3个区段，伯杰、捷诺、上海之江)。不同试剂盒的检测灵敏度有区别(102～103copy/mL)，判读应严格按照试剂盒说明进行[12]。CORMAN等[13]建议在常规工作流程中可将E基因检测作为一线筛选工具，RdRp基因(位于ORF1ab靶区内)作为确诊工具，也可直接单独检测RdRp基因。E基因检测灵敏度高达3.2 RNA copy/反应 (95%可信区间为2.2～6.8 RNA copy/反应)，RdRP基因高达3.7 RNA copy/反应( 95%可信区间为2.8～8.0 RNA copy/反应)。N基因灵敏度稍弱[13]。通过特异性的RdRP-SARSr-P2探针可以有效区分SASrCoV，有较高的特异度。通过确诊的198份标本验证，未出现假阳性[13]。CHU等[14]研究则表明检测临床标本N基因的灵敏度比ORF1ab基因高10倍，可能的原因是临床标本中的细胞被病毒感染后的亚基因组mRNA表达，导致样品中有更多的N基因拷贝。根据检测性能，建议将N基因检测作为筛选试验，ORF1ab基因检测作为确诊试验。N基因阳性/ORF1ab阴性结果应视为不确定，建议将该标本转至WHO参考实验室进行进一步检测[14]。总之，对患者标本进行核酸检测的意义重大。

注：1a/b为阅读框架1a/b；E为编码包膜蛋白的基因；S为编码刺突蛋白的基因；M为编码膜糖蛋白基因；3/6/7a/8/9b为编码辅助蛋白的基因3/6/7a/8/9b；N为核蛋白。

图1 人类SARS-CoV-2和SARSr-CoV基因组示意图[11]

1.1核酸检测是确诊和鉴别诊断SARS-CoV-2的重要依据，也是判断疗效的依据 核酸检测技术具有可早期诊断且灵敏度和特异度高等特点[15]。从《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第一版)》到《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，均将呼吸道标本或血液标本中RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性作为重要的依据[3]。测定SARS-CoV-2核酸是与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒感染等其他病毒感染进行鉴别诊断的重要依据。经治疗后，连续2次呼吸道病原体核酸检测阴性(间隔≥24 h)是解除隔离出院的重要依据[4]。

1.2判断病情严重程度 通过判断不同标本病毒检测结果可以判断感染范围。如咽拭子检测病毒核酸为阳性而支气管肺泡灌洗液检测病毒阴性，提示病毒感染灶可能主要限于上呼吸道，患者病情比较轻，易康复[16]。患者肺泡灌洗液中SARS-CoV-2核酸滴度高、持续高病毒载量时间长(1周以上)，继发暴发性心肌炎、左室射血分数下降、心室扩大的可能性大。对下呼吸道持续高滴度病毒患者要警惕重症化，特别应警惕病程早期病毒所致的暴发性心肌炎风险[16]。血液中(血清或全血)检测SARS-CoV-2阳性提示患者病情较重，应该引起足够重视[17]。

2 不同种类标本和不同厂家RT-PCR试剂对SARS-CoV-2核酸检测结果不一致

2.1不同类型标本PCR检测SARS-CoV-2核酸的结果不一致 PCR方法灵敏度和特异度都比较高。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[4]，呼吸道标本或血液标本均可用于检测SARS-CoV-2，但咽拭子、痰液、纤维支气管镜灌洗液、血液、肛门拭子、粪便标本PCR核酸检出率不一致[17-19]，痰液标本、支气管镜灌洗液中病毒基因扩增曲线信号均比咽拭子强[19-20]。上述研究提示，在排除COVID-19病例或解除隔离时，单独以咽拭子SARS-CoV-2核酸检测阴性为依据需谨慎，必要时应当采集痰液等下呼吸道标本进行检测。上呼吸道标本存在漏诊的原因可能是SARS-CoV-2作用的靶点ACE2受体主要分布在肺泡Ⅱ型上皮细胞[21]。因此，下呼吸道标本阳性率高于上呼吸道；在留取上呼吸道的标本之前患者准备工作不到位(清理鼻腔、饮水等)也容易造成漏检[21]。另一项研究表明，荧光PCR检测15例确诊的COVID-19患者不同标本中的病毒核酸，其中咽拭子阳性率为53.3%，肛拭子标本阳性率为26.7%，全血标本阳性率为40.0%，血清标本阳性率为20.0%，只有2例患者咽拭子和肛拭子标本均为阳性[17]，进一步提示单独检测某一种类标本中的核酸将造成一定的漏检率。

2.2不同品牌PCR试剂盒检出率有差异 有研究表明，同一患者咽拭子标本采用6种不同品牌国产PCR试剂盒检测SARS-CoV-2结果有差异，6个品牌的试剂最低检测限为500 copy/mL，检测的基因均为OFR1ab和N基因，其中3个品牌试剂检测不出OFR1ab，1个品牌试剂检测不出N基因[22]。同时，不同品牌试剂批内变异系数有差异，可能与不同品牌试剂盒引物设计不同、各位点检测灵敏度不同有关[8]。因此，对于有明显的临床症状和(或)符合COVID-19影像学表现，但核酸检测阴性的患者，可以考虑更换不同品牌的试剂盒进行检测，以增加检测的准确性，减少漏诊。

3 血清学检测SARS-CoV-2感染阳性率比较高，但需要进一步研究

有研究表明，在感染SARS-CoV-2后第5天，IgM和IgG阳性率分别为81%、100%。抗体检测阳性率比核酸检测阳性率(咽拭子：25.0%，肛拭子：37.5%)高[17]。因此，可以考虑动态监测病毒IgM或IgG(4倍增长)，作为核酸检测的补充手段。国家感染性疾病临床研究中心、深圳市第三人民医院(南方科技大学第二附属医院)、重庆医科大学联合博奥赛斯生物科技有限公司已研发出SARS-CoV-2血清学检测试剂盒，通过验证发热7～14 d的COVID-19患者有较高的临床符合率(IgM 和IgG均为 96.6%)。达安基因、珠海银科等公司已研制出检测SARS-CoV-2的化学发光免疫检测试剂盒。甘肃省医学科学研究院李克生教授团队成功研发出SARS-CoV-2抗原金标检测试剂盒，为SARS-CoV-2血清学检测奠定了技术基础。

血清学试剂盒最大的优势在于标本采集容易、标本处理和实验操作简单、测试时间短、速度快，适合用于大样本量筛查。基于金标法、ELISA法、化学发光法的血清学试剂盒各有优点。如金标法不需要特殊设备(甚至不需要离心机，将标本静置待血细胞自然沉降，血清析出就可以检测)，单个标本即可检测，随时采血随时可以检测，检测的时间很短，20 min内完成检测，成本比较低，对于基层实验室初步判断是否为SARS-CoV-2感染有一定的意义；缺点是灵敏度和特异度没有ELISA法和化学发光法高。ELISA法灵敏度超过金标法，操作时间为1～2 h，能够批量测试，成本低，检测速度快，适合在基层或大中型医院使用。

4 将核酸检测和血清学检测结合，提高检出率

鉴于目前SARS-CoV-2传染性比较强，早发现、早报告、早隔离、早治疗对于疾病的防控意义重大。核酸检测由于有一定的漏诊率，对SARS-CoV-2早发现、早隔离有一定的影响，因此，建议将血液标本抗体(抗原)检测加入相关的诊疗指南，以弥补RT-PCR核酸检测检出率比较低，容易造成漏诊的缺点。对于咽拭子RT-PCR核酸检测阴性拟作解除隔离出院的患者，可以考虑同时再采集痰液标本、肛拭子标本通过RT-PCR检测核酸，如均为阴性，再检测血清IgM抗体是否转阴，或者IgG抗体滴度是否不再增加，以作为核酸检测补充手段。

由于目前血清学检测SARS-CoV-2的研究报道非常少，因此，本文观点具有一定的局限性，有待后续全国血清学检测报道进行修订。