芍药苷预处理对肝缺血再灌注大鼠肝功能及线粒体损伤的影响*

黄 松,彭胜亮,卢 强,徐国海,杜晓红

南昌大学第二附属医院麻醉科,江西南昌 330006

肝缺血再灌注是肝移植、肝部分切除术等多种肝脏手术的必经程序。研究证明,肝脏手术围术期肝缺血再灌注容易诱发线粒体结构完整性的破坏,导致呼吸链、内外膜及基质蛋白功能和ATP合成的抑制,从而诱发肝细胞的凋亡[1-2]。轻者致患者术后肝代谢、解毒功能降低,重者致肝衰竭乃至全身多脏器功能障碍,明显增加了手术并发症的发生率和病死率[3]。芍药苷作为一类中药,可通过多种机制改善脑缺血再灌注损伤[4],但其在肝脏缺血再灌注肝功能及线粒体损伤中的作用尚不清楚。因此,本研究拟评价芍药苷预处理对肝脏缺血再灌注大鼠肝功能及线粒体损伤的影响,为临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠64只,6～8周龄,体质量250～300 g,由南昌大学动科部提供。采用随机区组设计法分为假手术组(S组)、肝缺血再灌注组(I-R组)、芍药苷组(PF组)和生理盐水组(NS组),每组16只。

1.2方法 按照参考文献[5]采用Nauta法构建大鼠70%肝脏缺血再灌注模型。腹腔注射氯胺酮麻醉,由上腹正中线切开进腹,暴露肝脏,分离韧带和系膜,显露第一肝门。I-R 组用无创血管夹夹闭肝十二指肠韧带致肝缺血60 min后松开血管夹恢复血流。操作过程中,夹闭血管时肝叶很快由鲜红色转变为暗红色,松开血管夹后缺血的肝脏很快恢复成鲜红色,说明肝脏缺血再灌注制备成功,遂关闭腹腔。S组仅解剖肝十二指肠韧带,遂关闭腹腔；PF组于模型制备前7 d通过尾静脉连续注射芍药苷30 mg/(kg·d)，共7 d,其余处理同I-R组；NS组于模型制备前7 d通过尾静脉连续注射0.9% NaCl注射液30 mg/(kg·d)，共7 d,其余处理同I-R组。

各组大鼠于再灌注6 h后再次麻醉,经心脏采血5 mL,不加抗凝剂,静置10 min,离心后取上层血清经日立全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。取大鼠肝右叶组织,采用DNA 断裂的原位末端标记(TUNEL)法测定肝细胞凋亡数,操作步骤按照试剂盒说明书进行。光镜下进行观察,每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400),计算总细胞和凋亡细胞,细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞计数/总细胞计数×100%,取其平均值。

另取部分肝组织,制备细胞悬浊液,过滤、洗涤、离心,制备单细胞悬液,利用荧光染料罗丹明123(Rh123)作为线粒体膜电位(△Ψm)的标记物,采用流式细胞仪测定△Ψm。

余下部分肝组织提取肝组织线粒体后,采用Clark 氧电极法检测线粒体呼吸功能(jieoulian 63),分别测算线粒体三态呼吸速率和四态呼吸速率(氧浓度降低值/实际时间),计算呼吸控制率(三态呼吸速率/四态呼吸速率)和磷氧比。

2 结 果

2.14组大鼠肝AI、AST及ALT的比较 与S组比较,I-R组、PF组、NS大鼠AI、ALT和AST水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；I-R组与NS组大鼠AI、ALT和AST水平差异无统计学意义(P>0.05)；与I-R组及NS组比较,PF组大鼠AI、ALT和AST水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠肝AI、AST及ALT的比较

注:与S组比较,*P<0.05；与I-R组比较,#P<0.05；与NS组比较,△P<0.05。

表2 4组大鼠线粒体呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比及△Ψm的比较

注:与S组比较,*P<0.05；与I-R组比较,#P<0.05；与NS组比较,△P<0.05。

2.24组大鼠线粒体呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比及△Ψm的比较 与S组比较,I-R组和PF组大鼠三态呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明显降低,四态呼吸速率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与S组比较,NS组大鼠三态呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比、△Ψm和四态呼吸速率差异无统计学意义(P>0.05)；与I-R组比较,PF组大鼠三态呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明显升高,四态呼吸速率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与NS组比较,I-R组和PF组大鼠三态呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明显降低,四态呼吸速率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨 论

肝脏缺血再灌注损伤是临床常见的病理过程之一,各种原因引起的休克、肝脏大手术时的肝门阻断、肝移植等均可以引起肝脏缺血再灌注损伤。肝脏缺血再灌注既可以引起肝细胞凋亡,也可以引起肝细胞坏死。本研究采用国内外广泛认可的Nauta法构建70%肝脏缺血再灌注模型[6],结果显示,与S组比较,I-R组血清ALT和AST的水平明显升高,光镜下肝组织病理学损伤明显,肝AI明显升高,提示肝脏缺血再灌注损伤模型制备成功。

ALT主要存在于肝细胞质内,其细胞内水平高于血清中1 000～3 000倍,是反映肝脏细胞功能最敏感的指标[7]。AST主要存在于肝细胞线粒体内,当肝脏发生严重坏死或破坏时,肝细胞线粒体受到损伤时,AST从线粒体中释放出来,才能引起AST在血清中水平偏高[7]。肝AI是肝细胞凋亡数与肝细胞总数的比值,反映肝细胞的凋亡情况。本研究结果证明肝脏缺血再灌注会造成肝功能的下降及肝细胞的凋亡,而经芍药苷预处理后,肝功能的下降和肝细胞的凋亡明显得到好转。

线粒体通路在细胞凋亡中起着重要作用。线粒体呼吸速率是线粒体功能的一项指标,线粒体四态呼吸是当线粒体内ADP耗竭,点子传递线粒体的耗氧量下降的呼吸状态,若此时加入ADP后线粒体的点子传递得以顺利进行,耗氧量增加,即为三态呼吸,因此,可以通过这两个阶段线粒体呼吸状态的耗氧率的比值来描述线粒体呼吸功能的强弱[8]。而磷氧比是线粒体在每消耗1 g原子氧的同时能够产生ATP的量,是表现线粒体氧化磷酸化耦联程度的指标,能够体现线粒体的能量转化效能。本研究结果证明肝缺血再灌注将造成肝细胞线粒体功能受损,而芍药苷预处理能改善此种情况。

△Ψm是衡量线粒体功能的重要指标之一,能够最直接地反映线粒体的能量状态,和线粒体的Ca2+摄取、ATP生成、蛋白质和代谢物的转运及ROS的生成密切相关[9]。△Ψm降低诱导肝细胞凋亡,近年来引起密切关注。当PTP开放时,相对分子质量<1.5×103的物质即可通过,内膜两侧离子梯度消失,△Ψm崩溃和电子传递脱耦联,线粒体膜通透性升高,释放促凋亡因子,可通过激活caspase-9及caspase-3引起级联反应。核酸内切酶彻底破坏细胞生命活动所必需的全部基因,caspase会导致细胞结构的全面解体,完成细胞凋亡[10]。因此,△Ψm的崩溃是细胞凋亡的早期事件。研究表明,与荧光分光光度法及激光共聚焦显微镜检测方法相比,流式细胞术可更准确地测定△Ψm,且操作简便[2]。

综上所述,芍药苷预处理能在一定程度上改善肝缺血再灌注造成的肝功能及线粒体损伤,相关具体机制及信号通路本研究团队正在进行下一步的研究。