紫檀芪对2型糖尿病大鼠肝损伤的作用

张玉晶，孙华磊，刘欣欣，王 腾，李 星，李文杰

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

据报道[1]，全球超过4.25亿人患有糖尿病，预计到2045年，糖尿病患者的数量可能会升至6.93亿；2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者约占糖尿病患者的90%。有研究[2]表明，炎症是T2DM的发病机制之一，可导致胰岛素抵抗。肝脏是胰岛素的主要靶器官之一，胰岛素通过肝细胞上的受体进入肝细胞，合成肝糖原，维持血糖稳定。当糖尿病发生时，血糖升高，代谢紊乱。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是一种天然的多酚类化合物，广泛存在于蓝莓、黑莓和其他浆果中。已有研究[3-6]报道PTE具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛、抗糖尿病、抗肥胖及神经保护作用。Kosuru等[7]发现PTE可以减轻糖尿病大鼠心肌氧化应激和炎症反应。本研究观察了T2DM大鼠肝损伤情况，并评价了PTE对大鼠肝损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料雄性4周龄SPF级SD大鼠50只(170～220 g，动物许可证号SCXK 2015-0004)，购自河南省实验动物中心。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，PTE购自上海士丰生物科技有限公司。ALT和AST比色法测试盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。IL-6和IL-1β ELISA检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，TNF-α ELISA检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。组织蛋白抽提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。IL-6多克隆抗体和NF-κBp50多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒、β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2T2DM大鼠模型的建立及实验分组50只大鼠分为正常对照组，模型组及低、中、高剂量PTE组，每组10只。除正常对照组外，其他4组采用高脂高糖饮食和STZ结合的方法诱导T2DM模型[8]，注射STZ 72 h后，大鼠空腹血糖为≥11.1 mmol/L并出现多饮、多食、多尿等症状，且1周后血糖水平未恢复正常即为造模成功。将PTE溶于羧甲基纤维素钠溶液中；正常对照组和模型组大鼠仅给予羧甲基纤维素钠溶液灌胃处理，而低、中、高剂量PTE组则分别给予20、40、80 mg/kg的PTE溶液灌胃处理。连续干预12周后麻醉，腹主动脉取血备用；随后处死大鼠，收集肝脏标本。

1.3肝组织形态学观察用40 g/L多聚甲醛溶液快速固定肝组织，石蜡包埋。4 μm厚切片，常规脱蜡脱水，HE染色，光学显微镜下观察。

1.4血清ALT、AST水平检测血样置于冰上30 min，5 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清。按照试剂盒说明书步骤测定血清ALT、AST水平。

1.5血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平检测取血样，分离血清，按照ELISA检测试剂盒说明书步骤检测血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.6肝组织NF-κB、IL-6蛋白表达水平的检测取肝组织称重，用组织蛋白抽提试剂盒提取蛋白。以BSA为标准品，BCA法测定总蛋白，然后用5×SDS蛋白电泳上样缓冲液进行变性处理。每个泳道蛋白上样量为80 μg，行SDS-PAGE，转膜，50 g/L脱脂奶粉溶液封闭1.5 h。加一抗(β-actin多克隆抗体按1∶5 000稀释，NF-κBp50、IL-6多克隆抗体均按1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，10 min/次。加入按1∶5 000稀释的二抗，室温孵育2 h。TBST漂洗3次，10 min/次。ECL化学发光，成像结果用Image J软件处理。以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 23.0处理数据。5组大鼠以上各项检测指标的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠肝组织形态及肝功能比较正常对照组肝组织结构清晰，胞质染色较深，肝细胞排列规则，未见明显的病理变化(图1A)。模型组肝小叶肝索结构紊乱，肝细胞肿胀、体积增大，细胞质疏松，局部炎性细胞浸润、出血(图1B)。与模型组相比，PTE各剂量组大鼠肝组织形态有不同程度的改善(图1C、D、E)。与正常对照组相比，模型组血清ALT、AST水平升高(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量PTE组ALT、AST水平均降低(P<0.05)；其中，高剂量PTE组的干预效果最为显著。见表1。

A：正常对照组；B：模型组；C：低剂量PTE组；D：中剂量PTE组；E：高剂量PTE组

表1 各组大鼠血清ALT、AST水平比较(n=10) IU/L

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

2.2各组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比较与正常对照组相比，模型组血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量PTE组IL-6水平降低(P<0.05)，高剂量PTE组IL-1β水平降低(P<0.05)，低、高剂量PTE组血清TNF-α水平下降(P<0.05)；且高剂量PTE组血清IL-6、IL-1β水平与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清炎性细胞因子水平比较(n=10) ng/L

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

2.3各组大鼠肝组织中NF-κB和IL-6蛋白表达水平的比较与正常对照组相比，模型组NF-κB和IL-6蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量PTE组NF-κB和IL-6蛋白表达水平降低(P<0.05)；其中高剂量PTE组NF-κB蛋白表达的干预效果最显著，而低剂量PTE组IL-6蛋白表达的干预效果最显著。见图2、表3。

A：正常对照组；B：模型组；C：低剂量PTE组；D：中剂量PTE组；E：高剂量PTE组

图2 各组大鼠肝组织中NF-κB和IL-6蛋白的表达

表3 各组大鼠肝组织中NF-κB和IL-6蛋白的表达(n=10)

*：与正常对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

3 讨论

肝脏是机体糖脂代谢的主要部位。有研究[9-10]表明，糖尿病会造成大鼠肝损伤，引起肝功能下降。本研究采用高脂高糖饮食和STZ诱导建立T2DM模型，观察PTE对T2DM大鼠肝损伤的干预效果。结果表明，模型组大鼠肝脏有明显水肿、炎性细胞浸润，同时血清ALT和AST水平升高，提示T2DM大鼠肝功能受损；而PTE干预可减轻T2DM大鼠肝组织病理变化，同时降低血清ALT和AST水平，且高剂量PTE干预效果更为明显。

胰岛素抵抗在糖尿病的发病中发挥重要作用，而炎症通过多种细胞因子和分子途径在胰岛素抵抗的发展中发挥重要作用[2]。据报道[11-12]，炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高与糖尿病严重程度有关。Chen等[13]发现减轻炎症可改善胰岛素抵抗。本研究结果显示，模型组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，PTE尤其是高剂量PTE干预后上述指标均有不同程度的降低，且高剂量PTE组血清IL-6、IL-1β水平与正常对照组相比，差异无统计学意义，表明PTE可能通过抑制炎症反应来保护肝脏免受损伤。NF-κB是一种转录因子，调节一系列重要生物过程的基因表达，如细胞凋亡、细胞增殖、DNA修复、免疫和炎症反应等[14-17]。以往的研究[18-19]表明NF-κB在糖尿病的发病机制中起着重要作用。NF-κB通路的激活会导致胰岛素受体底物(IRS-1或IRS-2)丝氨酸激酶磷酸化，阻碍胰岛素信号传递，最终可能导致胰岛素抵抗。此外，NF-κB通路参与了炎性细胞因子的产生，它们反过来又可以作为刺激物激活该通路[2]。Qureshi等[20]发现PTE具有蛋白酶体抑制剂的类似功效，它可以抑制NF-κB抑制物的激活，从而抑制炎性细胞因子基因的激活，进而减少TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。

在本研究中，T2DM大鼠肝组织中NF-κB和IL-6蛋白的表达水平均升高，而PTE干预可降低肝组织中NF-κB和IL-6蛋白的表达水平，其中高剂量PTE组干预NF-κB蛋白表达的效果最显著，而低剂量PTE组干预IL-6蛋白表达的效果最显著，考虑应与炎性细胞因子种类多样有关。虽然低剂量PTE处理后IL-6蛋白的表达水平有所降低，但炎性细胞因子众多，结合起来仍会刺激NF-κB的产生，故而PTE干预剂量越高，对NF-κB的抑制效果越好。我们的研究结果表明，PTE干预产生的保护作用可能与抑制NF-κB有关，具体机制将进行细胞实验进一步探索。

综上所述，PTE可减轻糖尿病大鼠肝损伤、减轻炎症反应，其具体机制可能与抑制NF-κB/IL-6通路及炎症反应有关。PTE或可用于糖尿病的辅助治疗。