雪梨枇杷果酒主发酵工艺优化及挥发性成分分析

佟 尧,吴紫薇,陈 娟,刘 骥,唐俊妮

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

枇杷为蔷薇科常绿乔木果树,其果实是枇杷栽培生产和消费者食用的主要经济器官,我国产量大约占世界枇杷总产量的70%[1]。枇杷果肉含有人体所必需的多种营养成分,是一类营养丰富具有保健功能的果品,并且具有很高的药用价值[2-4]。雪梨被称为“百果之宗”,果实饱满、香脆多汁,含有糖类、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质元素及有机酸等多种营养成分。传统医学上认为雪梨性味清凉甘甜,入肺,有生津、润燥、清热、化痰、保肝、促食欲、助消化、清洁肠道等功效[5-6]。目前,关于枇杷的研究大多是针对枇杷叶和果实的提取物及其功能[7],如枇杷叶中提取的多糖可改善大鼠肾小球损伤[8],枇杷叶提取物对卵清蛋白诱导的小鼠气道炎症也有抑制作用[9],枇杷果实提取物则可通过调节糖代谢、脂质代谢、氧化应激、炎症等预防非酒精性脂肪肝[10]。关于雪梨的研究主要是用于制作功能性饮料等[6,11-12],也有学者提取雪梨多糖运用在卷烟上[13]。可见,这两种水果均对人体健康有很大的益处。

自20世纪以来,人们对果酒的兴趣日益浓厚[14-15]。有多种多样的果酒被研发出来,如Tsegay等[16]研制了仙人掌果实发酵酒并对其工艺进行优化;Qi等[17]研制了菠萝果酒并进行评价。雪梨和枇杷是常见的食补搭档,关于雪梨枇杷复合发酵酒产品在市场上尚不多见。现有的研究更多的是单一发酵果酒,如刘红云等[18]以枇杷为原料酿制枇杷果酒,牛黎莉等[19]以皇冠梨为原料酿制梨果酒。只有少许雪梨和其他种类水果的复合果酒研制,如谭新佳等[20]研制了凉薯雪梨果酒,李潇等[21]以葡萄和雪梨为原料研制了葡萄雪梨复合果酒。随着消费意识的提高,消费者逐渐开始青睐更加健康绿色、口感更加符合大众要求的果酒饮料。

我国枇杷和雪梨品资源丰富,开发雪梨枇杷复合果酒,具有广泛的市场前景。因此,本文以雪梨和枇杷这两种营养价值高的水果为原料,研究果酒发酵工艺,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对复合果酒的挥发性成分进行分析,研制出一种符合现代人需求的复合果酒。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雪梨 四川省广元市;枇杷 四川省德昌县;安琪葡萄酒果酒专用酵母SY 湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司;偏重亚硫酸钾 拉曼德工厂;果胶酶(12000 U/g) 宁夏和氏璧生物技术有限公司;无水柠檬酸 潍坊英轩实业有限公司;白砂糖 成都市新纪元食品有限公司;其它试剂 均为国产分析纯。

JS30-230多功能搅拌机 苏泊尔股份有限公司;PYX-DHS·400-BS-Ⅱ型隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;SC-15数控超级恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C酸度计 成都世纪方舟科技有限公司;果酒酒精度计(0～25%vol) 河北省胜启仪表厂;2WAY阿贝折射仪 上海精密科学仪器有限公司;UV-6100紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;Thermos气相色谱质谱联用仪(配置Triplus进样系统) 美国Thermos公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果酒制备工艺流程与操作要点

1.2.1.1 果酒制作工艺流程

1.2.1.2 果酒制备操作要点 将采购的雪梨和枇杷剔除病果烂果,清洗后去皮去核,分别破碎打浆,按照雪梨与枇杷为6∶4的比例混合雪梨原浆与枇杷原浆后,立即加入偏重亚硫酸钾使SO2的添加量为80 mg/L并混合,加入添加量为40 mg/L的果胶酶后,混合均匀并置于40 ℃水浴中酶解2 h;使用白砂糖液将混合浆的糖度调节至23 °Brix,用柠檬酸调节混合浆pH为3.4～3.6;按照0.4 g/L的添加量将酵母加入白砂糖含量为5%的糖液中,在38 ℃下活化30 min,冷却至28 ℃后加入至混合浆中,混合均匀后在28 ℃下进行主发酵5 d,分离果渣后,获得雪梨枇杷发酵原酒,进行感官评价、理化性质分析以及微生物分析。

1.2.2 单因素实验 采用均分法确定每个因素最佳合适量。

1.2.2.1 雪梨与枇杷浆体积比确定 分别将雪梨浆和枇杷浆的比例调至3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3,加入添加量为80 mg/L的SO2,使初始糖度为23 °Brix,调节pH为3.5,加入0.4 g/L的酵母发酵5 d,分离果渣后进行感官评价及理化指标的测定。

1.2.2.2 酵母接种量确定 将雪梨浆与枇杷浆比例为6∶4的复合浆,使SO2的添加量为80 mg/L,调整初始糖度为23 °Brix,pH调节至3.5,分别加入接种量为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的酵母进行5 d的主发酵,分离果渣后进行感官评价及理化指标的测定。

1.2.2.3 SO2添加量确定 将雪梨浆与枇杷浆比例为6∶4,使SO2添加量为60、80、100、120、140 mg/L,调节初始糖度为23 °Brix,pH调整至3.5,加入接种量为0.4 g/L的酵母,进行5 d的主发酵,分离果渣后进行感官评价及理化指标的测定。

1.2.2.4 初始pH确定 雪梨浆和枇杷浆的比例为6∶4,加入80 mg/L的SO2,初始糖度为23 °Brix,调整pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,加入接种量为0.4 g/L的酵母,进行5 d的主发酵,分离果渣后进行感官评价及理化指标的测定。

1.2.3 正交试验设计 以单因素实验为基础,感官评价得分为评分指标,将雪梨与枇杷体积比、酵母接种量、SO2添加量和初始pH采用L9(34)正交实验法来确定,试验因子与水平表见表1。

表1 雪梨枇杷复合果酒主发酵工艺的正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for themain fermentation of snow pear loquat compound wine

1.2.4 感官评价、理化指标和微生物指标分析测定方法

1.2.4.1 感官评价指标的测定 由10人组成评定小组,要求具有一定食品感官评价知识基础,依照表2为评分标准进行评价。

表2 雪梨枇杷复合果酒感官评价标准Table 2 The sensory evaluation criteria for snow pear loquat compound fruit wine

1.2.4.2 理化指标的测定 酒精度测定:酒精度计;pH测定:pH酸度计;还原糖测定:斐林法[22];糖度测定:阿贝折射仪;总酸测定:酸碱滴定法[22];透光率的测定[23]:分光光度法,以蒸馏水作为空白,在680 nm波长处用1 cm比色杯测定透光率T%来反映酒的澄清度;色度测定[24]:分光光度法。

1.2.4.3 微生物指标的测定 菌群总数测定[25]及大肠菌群测定[26]。

1.2.5 雪梨枇杷复合果酒挥发性成分的测定

1.2.5.1 雪梨枇杷复合果酒的前处理 取5 mL雪梨枇杷复合果酒样于20 mL萃取瓶,加入1 g NaCl促进挥发性成分挥发,加盖密封,采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入萃取瓶,在80 ℃条件下预孵化30 min,萃取10 min。

1.2.5.2 GC-MS气相色谱分析 TR-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分流模式,分流比为20∶1;流速1 mL/min;升温程序:40 ℃保持3 min,以7 ℃/min升温至220 ℃并保持2 min;载气为99.999%氦气;进样口温度230 ℃;解吸时间2 min[27]。

质谱分析条件:电子电离源,电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;传输线温度220 ℃;全扫描模式,质量扫描范围30～550 amu。

1.3 数据处理

采用NIST质谱数据库进行检索,将检测出的化合物的结构特征与图谱进行比对。采用面积归一化法定量,确定雪梨枇杷果酒里的挥发性成分含量。采用统计软件SPSS 18.0和Excel处理数据并绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 雪梨与枇杷浆体积比对果酒发酵的影响 雪梨与枇杷浆体积比影响发酵果酒的口感和色泽,从表3可以看出,雪梨比重增加时,透光率也随之上升,果酒酒体清澈透亮。结合图1和表3可以看出,当梨与枇杷的比例为6∶4时,在发酵终点时酒精度达到9%vol,其透光率为最高,为92.60%;感官评价中,雪梨与枇杷体积比为6∶4的果酒较好地中和了雪梨与枇杷的味道,既有梨的清香,又有枇杷的甘甜,酸甜适中,无苦涩口感,其色泽呈淡橘黄色,色泽明亮,因此选择雪梨枇杷体积比为6∶4。

图1 不同雪梨枇杷体积比对酒精度的影响Fig.1 Effect of different snow pearand loquat volume ratio on alcohol degree

表3 不同雪梨枇杷体积比下果酒品质的比较Table 3 Comparison of the fruit wines quality with different ratios of snow pear and loquat

2.1.2 不同酵母接种量对果酒发酵的影响 酵母接种量过高时,会导致发酵速度过快,果酒风味变差,接种量过低,会延长发酵周期[28]。结合图2和表4可以看出,当接种量为0.2 g/L时,发酵速度缓慢,酒精度低,在感官评价中果味重于酒味。当接种量等于1.0 g/L,在发酵过程中,前期发酵速度明显快于其它接种量,发酵液中糖被消耗掉,最后发酵结束时,酒精度偏低。在接种量为0.6、0.8 g/L的时候,虽然酒精度较高,但在感官评定中酒体呈现黄棕色,口感发涩、发苦。当接种量为0.4 g/L时,发酵程度适中,呈现良好的理化指标,透光率高达91.70%,酒体清澈透亮,纯正柔和,颜色为雪梨枇杷果酒应有的淡黄色泽,口感爽口。因此接种量选择为0.4 g/L。

表4 不同酵母接种量下果酒品质的比较Table 4 Comparison of fruit wine quality with different proportion of yeast inoculation amounts

图2 不同酵母接种量下酒精度的变化Fig.2 Effects of yeast inoculationamounts on alcohol degree

2.1.3 不同SO2添加量对果酒发酵的影响 SO2能抑制酒体中微生物生长,SO2添加量低,对微生物的抑制能力弱,易导致酒体被污染,SO2添加量高,降低或抑制酵母菌的生长,无法发酵完全。由表5可知,当SO2添加量大于80 mg/L时,酒精度与透光率降低,糖度升高,说明此时SO2的含量过高,已经导致酵母细胞的活性降低。由图3可知,当SO2添加量为80 mg/L时,发酵程度高,到达发酵终点时,酒精度明显高于其他添加量。添加量为80 mg/L时,抑制了其它不利于发酵的微生物生长的同时,给予酵母细胞一个良好的生长环境,此时酵母细胞生长状态较为活跃,酒体发酵效果好。因此,SO2添加量选择为80 mg/L。

表5 不同SO2添加量下果酒品质的比较Table 5 Comparison of wine quality with different SO2 addition amounts

图3 不同SO2添加量下酒精度的变化Fig.3 Effect of SO2 addition amounts on alcohol degree

2.1.4 初始pH不同对果酒发酵的影响 初始pH的不同会导致酵母细胞表面带电状态不同[29],影响酵母细胞的新陈代谢和发酵效率[28],进而影响果酒的品质。从图4可知,随着pH上升,酒精度也在上升,在pH为4.0时到达最高点,其余初始pH在发酵过程中酒精度变化波动大,折线图增长时快时慢,不平稳。在感官评价中,pH越低,口感越酸涩,甜味越淡。结合图4和表6可知,当pH为4.0时,发酵过程平稳,易于控制,酒味较为浓郁,有明显的果香,酸甜适宜,更符合对于果酒的感官要求。因此,pH选择为4.0。

表6 不同初始pH下果酒品质的比较Table 6 Comparison of wine quality different proportion of initial pH value

图4 不同初始pH下酒精度的变化Fig.4 Effects of initial pH value on alcohol degree

2.2 主发酵工艺参数的正交优化

由表7可知,各因素对雪梨枇杷复合果酒的影响大小为D>C>B>A,即初始pH>酵母接种量>雪梨枇杷体积比>SO2添加量,说明初始pH是影响雪梨枇杷复合果酒的重要因素,综合各因素下雪梨枇杷复合果酒的品质性状,并结合感官评价指标确定雪梨枇杷复合果酒的最佳工艺组合为A2B2C2D1,即SO2的添加量为80 mg/L,雪梨枇杷体积比为6∶4,酵母接种量为0.4 g/L,初始pH为3.5。在相同实验条件下对A2B2C2D1组合进行验证实验,得到感官评价分数为91分。

表7 雪梨枇杷复合果酒主发酵工艺的正交试验结果Table 7 The orthogonal experiment results of the mainfermentation process with snow pear loquat compound fruit wine

2.3 雪梨枇杷复合果酒理化性质

参照正交实验优化后的最佳工艺组合条件,进行4组平行验证实验,5 d发酵结束后,最终得到果酒总酸平均值含量为7.60 g/L(以醋酸计算),剩余还原糖量平均值为8.32 g/L,pH平均值为3.56,透光率平均值为91.5%,酒精度平均值为9.51%vol,颜色强度为1.464。

2.4 雪梨枇杷复合果酒微生物指标检测

从表8中可知,雪梨枇杷复合果酒的菌群总数为11 CFU/mL。大肠菌群检测中,所有稀释度VRBA平板均无菌落生长,按标准要求,以小于1乘以最低稀释倍数计算,因此雪梨枇杷复合果酒中大肠菌群小于10-9MPN/mL,以上微生物检测指标均符合NY/T 1508-2017《绿色食品果酒标准》[30]。

表8 雪梨枇杷复合果酒微生物指标检测结果Table 8 The detection results of microbial indicatorsfor snow pear loquat compound fruit wine

2.5 雪梨枇杷复合果酒挥发性化合物结果与分析

经正交实验优化过工艺参数的雪梨枇杷复合果酒挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图见图5,鉴定出的主要挥发性成分以及部分挥发性成分见表9。

表9 雪梨枇杷复合果酒中挥发性成分分析结果Table 9 Analysis results of volatile flavor components in snow pear loquat compound wine

图5 雪梨枇杷复合果酒挥发性成分GC-MS总离子图Fig.5 CG/MS total ion current of volatile flavorcompounds ofsnow pear loquat compound wine

经GC-MS分析,综合图5和表9,雪梨枇杷复合果酒中能检测到有保留时间和峰面积的挥发性成分中SI(相似度指数)≥40的有30种,占总检出挥发性成分的92.18%。从表9中可以看出,其中酸类物质5种(3.77%),酯类物质15种(16.51%),醇类物质7种(71.31%),其他化合物3种(0.59%)。相对含量较大的有8种,分别为乙醇(57.35%)、异戊醇(8.95%)、癸酸乙酯(7.47%)、月桂酸乙酯(3.70%)、苯乙醇(3.37%)、辛酸乙酯(2.14%)、正癸酸(2.02%)、2-甲基-1-丙醇(1.17%),占雪梨枇杷复合果酒中总挥发性成分总量的86.17%。

梨果肉中的主要挥发性成分为醇类[31],枇杷果肉中的主要挥发性成分为醛类[32],与其相比,雪梨枇杷复合果酒中含量较高的挥发性成分为醇类和酯类,共占总挥发性成分的87.82%。发酵过程对酒体产生了影响,醇类和酯类对酒体的香味起着积极的作用。高级醇是酒精饮料中一类重要的挥发性香气物质[33]。在本实验雪梨枇杷复合果酒酒体中,高级醇有苯乙醇、异戊醇等醇类物质,其中苯乙醇带有玫瑰香气,而异戊醇可使酒体醇厚并具有回甜口感。酒体还含有具有香蕉气味的乙酸异戊酯、水果香味的正己酸乙酯和辛酸3-甲基丁酯、椰子香气的癸酸乙酯等酯类物质,使果酒具有美好的水果香气。

3 结论

本文通过单因素实验和正交实验,得出雪梨枇杷复合果酒在主发酵中,各因素对果酒酒精度影响次序为:初始pH>酵母接种量>雪梨枇杷体积比>SO2添加量,最佳工艺组合条件为雪梨枇杷体积比为6∶4,发酵原浆的初始pH为3.5,SO2的添加量为80 mg/L,酵母的接种量为0.4 g/L。此时,果酒总酸含量为7.60 g/L(以醋酸计算),剩余还原糖量为8.32 g/L,pH为3.56,透光率为91.5%,酒精度为9.51%vol。

经过顶空固相微萃取技术结合GC-MS技术分析雪梨枇杷复合果酒中挥发性成分,发现与主要挥发性成分为醇类的梨果肉[29]和主要挥发性成分为醛类的枇杷果肉[30]相比,雪梨枇杷复合果酒中含量最高的挥发性成分为醇类和酯类,一共占总挥发性成分的87.82%,该研究将为雪梨枇杷复合果酒的实际生产和应用提供科学性的理论支持。