四种稻瘟病生防菌的筛选及其活性评价

杨美华,康冀川2,*,雷帮星2,韩 龙,何 欢

(1.贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025; 2.贵州大学西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心,贵州贵阳 550025)

水稻是主要的粮食作物之一,全球有半数的人口以大米为主食[1-3]。由病原菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病则威胁着水稻的产量和品质,它是水稻最严重的真菌性病害之一,且有着传播速度快,流行性强,危害严重的特点[4-6]。

目前稻瘟病的防治方法主要是依靠化学手段和培育抗病品种[7],化学防治虽见效快,但长期使用化学药剂会有一定残留,不仅会危害人畜健康,同时也给环境安全带来一定压力[8],而利用抗病品种也难以达到控制稻瘟病的目的[9]。相比之下,生物农药针对性强、选择范围广,为农业可持续发展、保护生态环境及保障食品安全提供了物质基础和技术支撑[10]。因此,生物防治成为了研究者研究的焦点。生物防治是利用生物的种间关系,以某种生物去抑制另外一种生物的生长繁殖的方法[11]。目前利用微生物源制剂防治植物病害有良好应用前景,广泛应用于生产的有真菌、细菌及放线菌[12-13]。其中利用芽孢杆菌防治植物病害的研究较多,芽孢杆菌不仅能产生芽孢以度过不良环境,且能产生多种抑制植物病原菌的抗菌物质,是重要的微生物资源[14]。目前用于稻瘟病防治的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、多黏类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)等[15-16]。

本研究选取的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14用来防治稻瘟病还未见报道,目前纺锤形赖氨酸芽孢杆菌应用于生物防治的报道较少。本文通过对生防细菌进行拮抗活性的评价及对其发酵液耐高温、耐酸碱和抗紫外线等方面进行研究,以期为丰富稻瘟病生防菌资源及开发生防菌剂打下一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)D1、解淀粉芽孢杆菌hd213、解淀粉芽孢杆菌DEB-2、嗜麦芽寡养假单胞菌(S.maltophilia)he41、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)F2、枯草芽孢杆菌H3、缺陷假单胞菌(Brevundimonasbullata)hd13、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(L.fusiformis)he14和稻瘟病病原菌(M.oryzae) 贵州大学贵州省生化工程中心分离保藏;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、营养琼脂培养基(NA)、营养肉汤培养基(NB) 上海博微生物科技有限公司;氢氧化钠、盐酸 成都金山化学试剂有限公司。

SPX-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LDZM-60L-IH立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;ZQlY-180N振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;SW-CJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;Eppendorf高速离心机 Eppendorf公司;JA2003电子天平 上海天平仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 稻瘟病生防菌的筛选 采用平板对峙法测定供试生防菌对稻瘟病的抑制作用[17]。将活化培养的稻瘟病病原菌用直径为9 mm的打孔器打孔接种于PDA培养基平板中央,然后在其两侧对称等距接种经NA固体培养基28 ℃活化培养2 d的细菌,以只接种病原菌的平板为空白对照。在28 ℃恒温箱中培养10～12 d待空白对照长满平板,观察抑菌作用,测定病原菌菌落直径,计算抑菌率,每个处理重复3次。

1.2.2 生防菌发酵液的制备 将在NA固体培养基上经28 ℃培养2 d的细菌单菌落接入NB营养肉汤中,28 ℃、120 r/min恒温摇床培养24 h即得发酵种子液,然后以2%的接种量接种于装有100 mL NB营养肉汤液体培养基的250 mL的锥形瓶中,28 ℃、120 r/min恒温摇床培养48 h,得发酵液。发酵液经4 ℃、10000 r/min离心处理10 min,收集上清液,再用0.22 μm无菌过滤器除菌得无菌发酵滤液,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 发酵液对稻瘟病的抑制作用 采用生长速率法[18],用1×105Pa灭菌30 min后的PDA培养基(冷却至50 ℃)以体积比配制成分别含细菌发酵滤液0.5%、1%、2%、4%、8%、16%、32%、64%的不同浓度的培养基,摇匀后倒入直径为90 mm的无菌培养皿内制成平板,以不加发酵滤液的PDA培养基作阴性对照,每个处理重复3次。用直径9 mm的打孔器取已培养12 d的稻瘟病病原菌并接种于平板中央,于28 ℃恒温培养箱中培养12 d,测量各处理的菌落直径,计算相对抑菌率,计算方法同1.2.1。

1.2.4 生防菌遗传稳定的测定 将分离鉴定保存至今的细菌活化在NA平板上,在28 ℃恒温培养,待长出菌落后,每24 h转接一次,转接30次,其中选择第1、5、10、15、20、25、30次的细菌进行测定活性,基于1.2.3的方法选取PDA培养基含细菌发酵液体积为32%的方法,测定拮抗细菌对稻瘟病的拮抗活性,处理方法与1.2.3相同,测量菌落直径,计算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.5 发酵液的热稳定性 将分离鉴定保存至今的细菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制备好细菌发酵液并用0.22 μm的无菌过滤器过滤得无菌发酵滤液,将无菌发酵滤液分别置于40、60、80、100、121 ℃下处理30 min,冷却至室温后与PDA混合[19],其余操作方法同1.2.3。记录结果,测量稻瘟病菌菌落直径,计算抑菌率,方法同1.2.1。

1.2.6 发酵液的抗紫外线稳定性 将分离鉴定保存至今的细菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制备好细菌发酵液并用0.22 μm的无菌过滤器过滤得无菌发酵滤液,将制备好的细菌发酵滤液放在超净台上,液面高度调整为0.5 cm,分别照射无菌发酵液15、30、60、180、360 min后取出,经紫外线照射处理后的发酵液再经无菌过滤器过滤,以未经紫外线处理的发酵液作为对照抑菌活性效果。其余操作方法同1.2.3。记录结果,计算抑菌率,方法同1.2.1[20]。

1.2.7 发酵液的耐酸碱性 将分离鉴定保存至今的细菌在NA平板上活化,按照1.2.2的方法制备好细菌发酵液并用0.22 μm的无菌过滤器过滤得无菌发酵滤液,用5 mol/L氢氧化钠、36%的盐酸将发酵滤液的pH分别调为3、5、7、9、11,然后在室温下静置30 min,再将pH调为7,为防止污染,将经过处理的发酵滤液再经0.22 μm的无菌过滤器过滤,其余操作方法与1.2.3相同。观察并记录结果,计算抑菌率,方法同1.2.1[21]。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理,数据用平均值±标准差表示,采用单因素方差进行组间比较,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病生防菌的筛选

通过平板对峙实验,可以直观看到生防菌对稻瘟病菌的抑制效果,如图1所示。从8株供试菌株中筛出对稻瘟病菌有一定拮抗作用的菌株5株,在这5种菌中有4种有良好拮抗效果,其对稻瘟病菌的抑制程度见表1。通过计算,菌株D1、he41、he14及H3对稻瘟病引起的生长抑制均大于61%,F2次之,抑制率为59.30%,其余3株均无明显抑制作用,原因主要是:生防细菌能产生抗菌物质,抑制病原菌生长,但各生防细菌产生的抗菌物质存在差异,因此抗菌效果也不同[22]。

表1 不同拮抗细菌对稻瘟病菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effects of differentantagonistic bacteria on Magnaporthe oryzae

图1 平板上抗真菌活性测定Fig.1 Antifungal activity assays on Petri plates注:a:空白对照;b:解淀粉芽孢杆菌D1;c:嗜麦芽寡养假单胞菌he41;d:枯草芽孢杆菌H3;e:纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14;f:枯草芽孢杆菌F2;g:解淀粉芽孢杆菌DEB-2;h:缺陷假单胞菌hd13;i:解淀粉芽孢杆hd213。

2.2 生防菌发酵液对稻瘟病菌的抑制作用

表2结果表明,稻瘟病菌在含无菌发酵滤液的培养基上生长时被不同程度抑制,其菌丝生长抑制水平与无菌发酵滤液浓度呈正相关;当采用含0.5%发酵滤液的培养基培养稻瘟病菌时,稻瘟病菌菌丝依然能被轻微抑制,抑制效果在13.19%～25.02%之间;当发酵液所占的比例达到32%时,菌株D1、he41、he14、H3的无菌发酵滤液对稻瘟病菌的菌丝抑制率均达90%以上,抑菌效果明显;当发酵液所占的比例达到64%时,D1、he14、H3、he41的无菌发酵滤液能让稻瘟病菌的菌丝均不能生长,即抑制率达100%。这与蔡长平等[23]报道的放线菌CZ113的无菌发酵液对稻瘟病的抑制效果果相似。

2.3 生防菌转接培养后对稻瘟病菌菌丝的抑菌效果

菌株D1、H3、he41、he14继代培养30次,其中第1、5、10、15、20、25、30次的抑菌活性变化情况如图2所示,各次数之间的抑菌率没有显著差异,且所有的生防菌对稻瘟病菌菌丝的抑菌率都在86%～100%之间,表现了良好的遗传稳定性,因此菌株D1、he14、he41、H3不易发生遗传变异,能够稳定遗传。相关研究结果多有报道生防细菌在多次继代培养后依然能保持其抑菌效果。如张聪颖等[24]筛选到的枯草芽孢杆菌HT-6经连续传代10次后,对致病疫霉的抑菌率保持在80%以上。邹秋霞等[25]报道的枯草芽孢杆菌YN145继代培养25代后,对稻瘟病菌的抑制率保持在80%以上。综上所述本文获得的菌株D1、he14、he41、H3对稻瘟病菌的抑制作用与转接次数不呈相关性,有良好应用前景。

2.4 生防菌发酵液的热稳定性

生防菌无菌发酵滤液经不同温度处理后的结果如图3所示。图4直观地展示了菌株he14的无菌发酵滤液在不同温度处理后对稻瘟病的抑制效果。菌株D1、he41、H3的无菌发酵滤液在上述的温度下处理后对稻瘟病菌菌丝均无抑菌作用,表现了极差的热稳定性,说明它们所产生的抗菌物质在加热的条件下容易变性失活。由图3和图4可知,而菌株he14的发酵液在40、60、80、100 ℃的温度条件下处理后,对稻瘟病菌菌丝的抑菌率仍保持在90%以上,在121 ℃处理30 min后,抑菌率下降到82%,但也表现了良好的热稳定性;菌株he14所产生的抗菌物质大概分为两部分,即大部分为耐高温,少部分为对温度敏感,易变性失活。据相关文献报道,抗菌物质经100、120 ℃处理后保持其良好抗菌活性的生防细菌较少,如多粘类芽孢杆菌F17的无菌发酵液经高温处理后散失抗菌活性,短小芽孢杆菌F1和枯草芽孢杆菌H1的无菌发酵液对温度有良好的耐受性,经高温处理有明显抗菌作用[26]。解淀粉芽孢杆菌Y5-18发酵液中的活性物质经100 ℃处理30 min后的抑菌率为60%[27]。与这些菌株相比,菌株he14的抗菌活性物质对温度有更好的耐受力。

图3 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14菌株发酵滤液在不同温度处理30 min后对稻瘟病菌生长的拮抗作用Fig.3 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 under differenttemperatures for 30 min on mycelium growth of M.oryzae

图4 不同温度对纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14菌株发酵液抑制稻瘟病菌的影响Fig.4 Different temperature effect the fermentation supernatantfiltrate of Lysinibacillus fusiformis he14 inhibiting the growth ofM. oryzae temperatures for 30 min on mycelium growth of M. oryzae注:a:空白对照;b:40 ℃;c:60 ℃;d:80 ℃;e:100 ℃;f:121 ℃。

2.5 生防菌发酵液的抗紫外线稳定性

四株拮抗菌的发酵滤液经紫外线照射不同时间后的结果如图5,结果表明,菌株D1、he41、H3、he14的发酵滤液经紫外线照射15、30、60、180、360 min对稻瘟病菌菌丝的抑菌率仍保持在83%～95%之间,抑菌率与照射时间不呈相关性,表现良好的抗紫外线稳定性;其中菌株D1的抑菌率都为95%,效果最好;菌株he14、H3、he41的抑菌率稍次于菌株D1,但抑菌率仍在83%以上。相关研究结果多有报道生防细菌的抗菌物质经长时间紫外照射仍能保持良好的抑菌效果,解淀粉芽孢杆菌CWJ2经紫外线处理30 min后的抑菌效果略有上升[28]。变绿色粘球菌YR-35的无菌发酵液经30 W的紫外灯处理后,对马铃薯晚疫病的抑菌率保持不变[29]。本文的研究结果与已报道的研究结果相似。

图5 菌株D1、he41、H3、he14发酵滤液在紫外线下照射不同时间后对稻瘟病菌生长的拮抗作用Fig.5 Antagonistic effect of fermentation filtrates ofstrains D1,he41,H3 and he14 on the growth ofM. oryzae after ultraviolet light irradiation for different time

2.6 生防菌发酵液的耐酸碱性

不同pH条件下菌株D1、he41、he14、H3的无菌发酵滤液对稻瘟病菌的抑菌活性变化情况如图6。结果显示,在pH在3～11之间变化时,菌株D1、H3、he41的无菌发酵滤液对稻瘟病菌菌丝的抑菌率保持在90%以上,抑菌率无明显变化;菌株he14的无菌发酵滤液在pH11.0的偏碱环境时,抑菌活力下降到82.12%。相关研究结果显示,在偏酸和偏碱环境下生防菌抗菌物质的抗菌效果弱于中性环境[30]。菌株SR13-2、WL2、YQ5的发酵液在pH2.0～12.0内保持稳定,但在pH为2.0、12.0时对致病疫霉的抑菌率明显低于中性环境[31-33]。与报道的菌株相比,此研究的菌株D1、he41、H3、he14更具优势,pH在3～11内保持稳定,具有潜在的研究意义。

图6 菌株D1、he41、H3、he14发酵滤液在不同pH处理30 min后对稻瘟病菌生长的拮抗作用Fig.6 Antagonistic effect of the fermentation supernatantfiltrate of D1,he41,H3 and he14 under different pHfor 30 min on mycelium growth of M. oryzae

3 讨论

近年来,筛选出高抑菌效果的生防菌株抑制稻瘟病菌、防治稻瘟病已成为水稻病害防治中的研究热点。Meng等[34]研制的枯草芽孢杆菌T249粉剂,对稻瘟病的田间防治效果为77.6%～78.5%。Saikia等[35]分离的侧孢短芽胞杆菌BPM3的发酵滤液对稻瘟病的防治效果为30.0%～67.0%,可减少35.05%～56.5%的产量损失。Suryadi等[36]筛选的坚强芽胞杆菌E65的发酵液对稻瘟病菌的抑菌率为73%～85%。沙月霞等[37]分离的解淀粉芽孢杆菌S170对稻瘟病的温室防治效果达80.57%。

目前,对生防芽孢杆菌的研究已深入到了许多方面,芽孢杆菌能够产生脂肽类物质和抗菌蛋白等,对多种植物病原菌具有高效抑制作用[38]。Arima等[39]发现枯草芽孢杆菌产生的表面活性素具有抗病毒、抗支原体和抗细菌活性。Cho等[40]发现,枯草芽孢杆菌KS03的主要抗菌化合物是伊枯草菌素A2。高娃等[41]的研究表明,解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白Tas A基因的表达产物可以高效抑制黄瓜灰霉病。Yoshid等[42]报道从解淀粉芽孢杆菌RC22分离的抗菌蛋白对桑树病原菌有良好抑制作用。本研究中的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14经30次继代培养,其无菌发酵滤液可耐受121 ℃高温(30 min)、紫外线照射6 h、pH3～11,抑菌率保持稳定,本研究同时还选取了稻瘟病菌另外两个生理小种也进行了试验,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14对其抑菌率也均达82%以上,且纺锤形赖氨酸芽孢杆菌he14用来防治稻瘟病还未见报道,具备了良好的研究价值。

4 结论

本研究的菌株D1、he41、H3、he14能稳定遗传,其代谢产物对稻瘟病菌有良好的抑制效果,且其抗菌物质有明显的耐酸碱稳定性、抗紫外线稳定性,菌株he14的抗菌物质具有明显的热稳定性,121 ℃下处理30 min仍能保持82%的抑菌活性,与报道的相比更好。利用这些特性菌株he14可作为生防菌剂开发的潜能。本研究将会进一步菌株D1、he41、H3、he14对稻瘟病的生防效果、抗菌物质结构和抑菌机理,为其在农业生产应用做好基础。