杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备及免疫效果评价

何亚鹏，时晓，李博，魏凯，杜迎春

（北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100）

杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida,As）属于气单胞菌属，形态为短杆菌，革兰氏染色阴性，其在淡水与海水环境中广泛存在，之前研究认为其不能在37℃生长，是嗜冷无动力型气单胞菌，但近期的一些山羊和人类的病例表明其可能为人-畜-鱼共患病原菌。目前已发现多个亚种，即典型亚种1种（杀鲑亚种），不典型亚种4种（无色亚种、杀日本鲑亚种、产果胶亚种及史氏亚种）。该菌最早由德国发现，欧洲、美洲、亚洲和非洲均有分布，是世界性的咸淡水养殖动物病原菌，主要引起16种鲑鳟鱼类如各类大马哈鱼、细鳞鲑、大西洋鲑、虹鳟和河鳟等鲑鳟鱼疖疮病及溃疡病，死亡率高；其宿主范围也在不断扩大，有引起金鱼、鲤鱼等鲤科鱼类的溃疡病和红皮炎的报道，最近研究发现还可感染七鳃鳗科和鮨科鱼类，如果任其流行蔓延不仅会危害我国鲑鳟鱼、鲤科鱼类等养殖业的健康发展，还会进一步威胁珍稀鲑鳟鱼物种的生存，影响其救护和繁育工作的开展。针对我国冷水鱼养殖和救护中疖疮病及溃疡病常发且危害严重的现状，该研究制备杀鲑气单胞菌灭活疫苗，进行免疫效果评价试验，取得了较好的结果。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

试验用的细鳞鲑采集自本单位养殖区，由实验室暂养。细鳞鲑体长为12 cm左右，体质量为10 g左右，鱼体体色正常、体表无损伤。试验前放于室内试验箱中暂养2周，水温控制在14℃左右，每天投喂2次商品化冷水鱼饲料。

1.2 菌种来源

杀鲑气单胞菌由北京市水生野生动植物救护中心分离自患疥疮病鱼并保存[1]。

1.3 灭活疫苗的制备

取冻存的的杀鲑气单胞菌，接种于普通琼脂培养基，25℃培养18 h后，观察菌落正常。挑取单菌落接种于5 mL TSB肉汤培养基中25℃、200 mg/L震荡培养24 h。向已制备好的菌液中加入适量甲醛（终浓度为0.3%），37℃恒温灭活48 h，涂板检验无活菌后，菌液离心收集菌体，用PBS洗涤菌体4次，洗去菌体中残留的甲醛，最后将菌体用无菌PBS稀释，分别加入适量不同佐剂，即制得杀鲑气单胞菌全菌灭活疫苗。采用麦氏比浊法调整菌浓度为2.0×108CFU/mL，取弗氏佐剂与等量灭活菌悬液分别吸入2个注射器内，排净空气，2个注射器之间以三通连接器相连，然后交替推动针管，进行疫苗乳化，直至形成粘稠的乳剂，即为弗氏佐剂疫苗[2]。

1.4 免疫接种和血液采集

将细鳞鲑分为A、B、C三组，将浓度为1.0×108CFU/mL的弗氏佐剂疫苗、不加佐剂全菌灭活疫苗及PBS，采用腹腔注射方式分别进行免疫细鳞鲑，A组为弗氏佐剂疫苗，B组为不加佐剂全菌灭活疫苗，C组为PBS，每尾200 μl，观察1周内鱼的健康状况及存活情况，进行疫苗的安全性检验。确定疫苗安全后，同样的方法将试验鱼分别免疫，于第1 d和注射后第7、14、21、28和 35 d 采血。每组随机取 5 尾，尾柄静/动脉采血，收集血清备用。

1.5 抗体效价测定

采用传统的试管凝集法检测血清抗体水平，观察细菌的凝集程度，计算每组的平均值，作为结果[3]。

1.6 免疫保护率测定

进行免疫28 d后，各组鱼随机取30尾，腹腔注射0.1 mL杀鲑气单胞菌活菌液（1.0×108CFU/mL）进行攻毒试验，观察记录12 d内的死亡情况。根据公式计算免疫保护率（Relative percent survival,RPS）∶RPS=[1－（免疫组死亡率/对照组病死率）]×100%[4]。

2 结果

2.1 抗体效价检测结果

方法1.5中试管凝集法测得试验组的抗体效价呈上升趋势，弗氏佐剂组血清平均抗体效价在第1～28 d逐步上升，在28 d达到峰值，为1∶460.8，之后缓慢下降；不加佐剂组血清平均抗体效价于免疫后呈上升趋势，在21 d达到峰值，为1∶281.6，之后缓慢下降；对照组无变化。

2.2 免疫保护率检测结果

免疫28 d后，各免疫组和对照组细鳞鲑的累计死亡数见图2。统计攻毒10 d后，弗氏佐剂组、不加佐剂组和对照组细鳞鲑的病死率分别为为13.3%、20%和76.7%，根据公式计算得出弗氏佐剂组和不加佐剂组的相对免疫保护率分别为82.7%和73.9%（表 2）。

表1 各免疫组鱼血清凝集抗体效价的检测

图1 活菌攻毒后各组的累计死亡数

表2 活菌攻毒后各组的病死率和免疫保护力

3 讨论

杀鲑气单胞菌广泛存在于水体环境中，该病原引起的疥疮病和溃疡病每年都会对相关行业造成很大损失，对冷水鱼养殖行业和珍稀水生动物保护有较大的威胁。鱼类疫苗发展较畜牧兽医业晚，在生产中应用的较多的仍是灭活疫苗。该杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备试验利用甲醛制备杀鲑气单胞菌全菌灭活疫苗，试验发现最低终浓度为0.3%甲醛可以将菌液完全灭活；免疫后弗氏佐剂组及不加佐剂组细鳞鲑的血清平均抗体效价于免疫后呈上升趋势，弗氏佐剂组的抗体效价更高。随后进行免疫保护实验，结果表明弗氏佐剂全菌灭活疫苗保护效果可达到82.7%，弗氏佐剂疫苗可以缓慢的释放抗原，能够使细鳞鲑产生较持久的免疫力，该试验为进一步开发和应用杀鲑气单胞菌疫苗奠定了基础。