穴位埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜形态及血清SOD、MDA含量的影响

马林， 章小梅， 黄德裕

（1.中山市陈星海医院针灸科，广东中山 528415；2.佛山市仁和中医院，广东佛山 528200）

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是因胃黏膜上皮受到多种因素损害，黏膜固有层腺体减少，伴有或不伴有纤维化生、肠腺化生和/或假幽门腺化生的一种慢性胃部疾病[1]，萎缩性胃炎伴有中度以上肠化生或者异型增生可视为胃癌的癌前病变[2]。现代医学对CAG 病因和病理机制的研究尚未完全明确，普遍认为该病与幽门螺旋杆菌感染、遗传和胆汁反流等因素有关。目前的治疗主要集中在针对病因、改善症状和缓解胃黏膜炎症等方面，主要的西医治疗原则是根除幽门螺旋杆菌、抑酸护胃，中医中药对GAG 的治疗也有积极的作用[3]。中医针刺疗法可以改善CAG患者的临床症状，并且疗效确切。穴位埋线属于中医针刺疗法之一，具有操作简单、疗效持久且价格低廉的优点，临床可见诸多报道，但多数属于叙述性研究，缺乏循证对照和重复性，难以科学体现穴位埋线的优势。本课题组前期研究[4]提示，穴位埋线能抑制JAK2/STAT3转导系统的异常激活，降低CyclinD 1 等靶因子的表达水平，从而起到改善CAG 的作用，但其治疗机制有待进一步探讨。本研究拟观察穴位埋线后CAG模型大鼠胃黏膜的形态和血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD） 及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）的含量变化，以期进一步阐明其改善CAG的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料

SPF 级8 周龄雄性大鼠64 只，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SYXK（粤）2013-0034。动物饲料：清洁级普通饲料，由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠饲养于广州中医药大学实验动物中心实验室，采用架式分笼喂养，恒温（20 ±1）℃，湿度45%～60%，明暗周期12 h 交替，自动通风8～15 次/h 条件下饲养。实验遵守《关于善待实验动物的指导性意见》中的动物保护和伦理原则。

1.2 药品与试剂

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG，日本东京化成工业株式会社生产，批号：TCI-M0527-5g）；10%福尔马林中性缓冲固定液（广州维格斯生物科技有限公司）；大鼠SOD、MDA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，产品批号分别为：A001-3、A003-2）。

1.3 主要仪器

6 号一次性注射针头（浙江康德莱医疗器械公司）；4-0号铬制羊肠线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；光学显微镜（XSP-C 204，上海莱卡公司）；切片机（RM 2016，上海莱卡公司）；包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司）；脱水机（JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司）；振荡器（QB8002，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；酶标仪（MK3，美国Thermo Multiskan 公司）；离心机（LX200，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；涡旋混合器（KB3，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；PBS 缓冲液（G0002，武汉谷歌生物科技有限公司）；苏木素染液（G1004，武汉谷歌生物科技有限公司）；中性树胶（G1403，谷歌生物）。

1.4 模型制备

所有SD 大鼠均给予普通饲料适应性喂养1 周后，将64 只大鼠按照随机数字表随机分成空白组15 只和造模组49 只。空白组给予普通饲料配合蒸馏水常规喂养，不予造模，每天给予等容积生理盐水灌胃。造模组大鼠参考文献[5]方法略加改进，复制CAG模型：将MNNG加蒸馏水调配为1 g/L的母液，置于4 ℃冰箱并用锡纸覆盖避光保存备用。使用时取用母液加入自来水配制成100 μg/mL的饮用液，供大鼠自由饮用，每24 h更换溶液1次，同时配以饥饱失常法，即大鼠饱食1日，禁食1日，交替进行，每周测体质量1次。根据前期经验，造模组大鼠自16 周开始，每周随机剖杀2 只大鼠，对胃黏膜组织进行光镜和病理检测，以确定模型是否复制成功。造模第22周大鼠胃黏膜病理显示，腺体减少，排列紊乱，局部坏死，符合大鼠慢性萎缩性胃炎诊断标准[5]，提示造模成功。

1.5 动物分组与治疗

取造模组大鼠49只，从第16周开始每周剖杀2 只，至第22 周造模成功，期间共杀检大鼠14 只。造模过程中死亡3只，其中，2只大鼠因为打斗后伤口感染死亡，1只大鼠因为长期不明原因不进食而死亡，其余大鼠均未出现明显的不良情况。采用随机数字表将32 只成模大鼠随机分为模型组和埋线组，每组各16 只，同时配合预先设置好的空白组15 只，最终分为3 组，即模型组、埋线组和空白组，3 组采用相同的喂养方式继续喂养，均自由进食和饮用蒸馏水。埋线组采取穴位埋线治疗，参考《实验针灸学》[6]选取脾俞、中脘、足三里穴，将0.5 cm长的4-0号铬制羊肠线从6 号一次性注射针头的针尖处装入针体（此时注射针头内作为针芯的30 号1. 5 寸不锈钢毫针稍退后），线头与针尖内缘齐平，背腰部穴位由局部下方向上平刺，下肢穴位直刺，刺至所需深度，边推针芯，边退针管。将羊肠线埋植于穴位皮下组织或肌层内，线头不外露，消毒针孔，外敷无菌敷料，胶布固定24 h。每10 d治疗1 次，共埋线治疗6次。模型组大鼠造模后只抓取，不治疗。空白组正常喂养。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 一般状态观察 对各组大鼠的毛色、精神状态及活动情况进行观察和比较。

1.6.2 胃黏膜的大体观察和光学显微镜观察 大鼠在取材前24 h 禁食但不禁水，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）进行麻醉，待麻醉后迅速剖腹，摘取全胃，沿大弯至小弯方向剪开，以0.9%氯化钠溶液加以清洗，对剪开的胃组织做肉眼大体观察，包括黏膜的色泽、弹性、皱襞多少、黏液覆盖量以及有无出血点。然后，选取典型的胃黏膜组织约3 mm × 5 mm，固定于10%中性甲醛溶液中，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度大约为4 μm，苏木素—伊红（HE）染色后，乙醇脱水，二甲苯透明树脂胶封片，行光学显微摄影，并于光镜下观察胃黏膜炎症细胞浸润以及肠化生和癌变情况。

1. 6. 3 大鼠血清SOD 和MDA 含量检测 按照“1.6.2”项下方法处死大鼠，用负压真空管于腹主动脉采血，以3 000 r/min离心10 min，获取上层血清，用0.5 μL离心管分装并置于-80 ℃冰箱中保存备用。以上制备的血清标本采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测方法测定大鼠SOD、MDA含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计方法

数据采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况比较

空白组大鼠营养状态良好，好动，皮毛顺滑，有光泽，饮食饮水正常，精神状态良好，行动灵活，二便正常。模型组大鼠精神状态不佳，皮毛光泽差，毛色灰暗，活动缓慢，精神状态萎靡，喜卧，摄食量减少，自主活动减少。与模型组比较，埋线组大鼠毛色有光泽，摄食量增多，活泼好动，自主活动均有明显增加，精神状况有所改善。说明穴位埋线可以改善大鼠的皮毛光泽度、精神状态、饮食饮水以及行动灵活性等情况。

2.2 各组大鼠胃黏膜大体观察结果

空白组：胃黏膜整体具有弹性，皱襞形态规则，黏膜表面光滑有光泽，黏膜外观橘红色，表面覆盖多量黏液，无出血点。埋线组：黏膜较有弹性，黏膜外形较规整，黏膜外观暗红色，黏膜表面覆盖中量黏液，肉眼可见散在出血点。模型组：胃黏膜整体扩张，胃壁弹性差且整体变薄，皱襞低平或消失，黏膜颜色灰白，表面少量黏液依附，可见大量出血点。

2.3 各组大鼠胃黏膜光镜观察结果

空白组：胃黏膜厚度正常，上皮细胞与腺体排列有序，且形态基本一致，细胞呈单层柱状排列，腺体丰富，腺体和胃小凹之间分界清晰，黏膜和固有腺体无充血、水肿及增生。见图1-a。埋线组：胃黏膜厚度适中，腺体排列次序总体规则，可见局限紊乱。细胞形态结构基本一致，黏膜表层可见炎细胞浸润，固有腺体完整。个别腺体有萎缩性改变，但无明显坏死。见图1-b。模型组：胃黏膜层变薄，而肌层变厚，胃小凹变浅，腺体缩小，腺体和胃小凹之间分界模糊不清，排列杂乱，数量减少，可见大量囊性扩张，呈空泡状，多量间质、纤维组织增生，并可见淋巴细胞浸润和腺上皮化生。见图1-c。

图1 各组大鼠胃黏膜病理形态比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathomorphological features of gastric mucosa in rats of various groups（by HE staining，×200）

2.4 各组大鼠血清中SOD和MDA含量的比较

表1结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血清SOD 含量显著降低，MDA 含量显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，埋线组大鼠血清SOD 含量显著升高，MDA 含量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清中SOD和MDA含量的比较Table 1 Comparison of the serum SOD and MDA contents in rats of various groups (±s)

表1 各组大鼠血清中SOD和MDA含量的比较Table 1 Comparison of the serum SOD and MDA contents in rats of various groups (±s)

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别空白组模型组埋线组N/只15 16 16 SOD[J/（U·mL-1）]192.19±7.14 156.03±7.01①185.81±5.19②MDA[c/（nmol·mL-1）]5.53±0.91 8.96±1.21①6.46±0.90②

3 讨论

慢性萎缩性胃炎（chronicatrophicgastritis，CAG）是常见并且难治的消化系统疾病，重度慢性萎缩性胃炎常被定义为癌前病变，西医对本病尚无特效治疗手段，中医特色疗法对本病的治疗具有明显优势。本课题组通过观察穴位埋线疗法对CAG模型大鼠胃黏膜形态的改变和血清SOD、MDA 含量的影响，探讨穴位埋线疗法改善CAG 的可能作用机制。

本研究结果显示：埋线组大鼠胃黏膜的弹性、形态、颜色和表面黏液以及有无出血点等多项观察指标同空白组接近，肉眼所见大鼠胃黏膜外观接近空白组，而较模型组明显改善，说明穴位埋线疗法能够明显改善鼠胃黏膜的外在形态。研究[7]报道，通过对CAG 大鼠足三里、中脘、胃俞进行穴位埋线和针刺治疗，结果显示：穴位埋线对CAG的治疗作用可能与其能促进胃液分泌、改善胃黏膜病理形态变化有关。该研究结果与本研究结论有相似之处。

SOD 是生物体组织中广泛存在的一种金属蛋白酶，具有催化自由基的歧化反应，推动超氧阴离子氧化并降低其细胞毒性，保护细胞膜等功能。SOD 活性的高低是机体清除自由基能力的直接反应，机体的氧化应激反应会在SOD 活性降低的状态下得到释放[8]，生理状态下，氧自由基的含量处于一种动态平衡中。研究[9]表明，机体大量蓄积的自由基可损伤细胞膜和蛋白质，其广泛参与了炎症、肿瘤等疾病的发生和发展过程。另外，自由基可诱发脂类的过氧化反应，不饱和脂肪酸的过氧化产物就是MDA，其可以间接反应细胞受损的程度。相关研究[10]显示：体内过量的MDA 等过氧化物可对胃黏膜造成损伤。SOD 和MDA 的综合观测结果是反映机体清除氧自由基能力和机体受自由基攻击程度的重要参考[11]。本研究结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血清SOD含量显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，埋线组大鼠血清SOD 含量显著升高，MDA 含量显著降低（P＜0.01）。本研究采用MNNG 制备大鼠CAG模型，对大鼠胃黏膜造成了损伤，提示胃黏膜的炎症损伤可以导致机体抗氧化能力降低而过氧化作用增强。有研究[12]显示：束缚应激方法能够导致大鼠胃黏膜形成应激性溃疡，且胃黏膜损伤溃疡指数同MDA含量呈正相关，与SOD/MDA的比值呈负相关。以上研究结果同本实验结论相类似。研究[13]报道，穴位埋线能够改善CAG 大鼠胃黏膜超微结构、保护胃黏膜。穴位埋线可提高大鼠脑组织SOD 活性而降低MDA 含量，从而产生对脑组织的保护作用[14]。所以，我们认为，穴位埋线对机体组织的治疗作用是没有组织选择性的，影响机体组织SOD、MDA 含量是实现其治疗作用的途径之一。

综上所述，SOD 与MDA 的含量水平可视为评价CAG 病情及预后的生物学标志之一，其可能的作用机制是穴位埋线治疗能够提升机体细胞的抗氧化能力，同时清除体内过量的过氧化物从而达到保护胃黏膜的作用，最终逆转CAG 向胃癌发展的病理进程。Arimoto 等[15]研究表明，过量的自由基能够激活癌症基因而产生癌变，故今后研究方向可以结合肿瘤免疫学做进一步深入的研究，这也许是将来针刺研究的重要方向。