碱提红花蜂花粉多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠的影响

史天洁，李淑芳，左绍远,2

（1.大理大学基础医学院，云南 大理 671000，2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000）

蜂花粉(bee pollen)系蜜蜂从蜜源植物雄性花蕊内采集的花粉粒，采集过程中，工蜂将口腔分泌物、花蜜湿润花粉后，将花粉粒加工而成的扁圆形状蜂花粉颗粒。蜂花粉是传统营养食品，具有多种生物学活性和药理作用[1]。多糖是蜂花粉的主要活性成分之一，研究表明，不同来源的蜂花粉多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物学活性[2]。我们前期研究表明，水提红花蜂花粉多糖的不同组分具有抗肿瘤、提高机体免疫力等作用[3-4]。多糖的结构与其活性密切相关，而不同提取方法其结构与活性有较大的差异[5]。为进一步观察红花蜂花粉多糖的生物学活性，我们对稀碱提取的红花蜂花粉多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用进行了实验研究。

1 实验材料

1.1 主要试剂

超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。D-半乳糖，上海国药试剂集团。其余试剂均为国产分析纯。红花蜂花粉，云南滇峰蜂业有限责任公司产品（批号：20170516）

1.2 主要仪器

RE-52A 型旋转蒸发仪(上海亚东生化仪器厂);FD-1 型冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司);UV 2550 型紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司),T10 高速组织匀浆机（上海越磁电子科技有限公司）。

1.3 红花蜂花粉多糖

参考文献[6]稍作改变。称取红花蜂花粉500 g，用石油醚回流2 h，过滤。滤渣自然晾干，用95%乙醇回流2 次，每次2 h,过滤。滤渣晾干后加15 倍体积蒸馏水，70℃水浴提取8 h 去除水溶性多糖，过滤。滤渣晾干，加入12 倍体积的0.05 moL/L NaOH 45℃提取4 h，过滤，收集滤液，滤渣加入8 倍体积的0.05 moL/L NaOH 45℃提取2 h，过滤，合并滤液，用5.0 moL HAc 中和至pH=7。减压浓缩，加95%乙醇至终浓度为75%（体积分数），置4℃过夜，离心取沉淀。沉淀用Sevage 法脱蛋白（三氯甲烷：正丁醇=4∶1）至280 nm 无明显吸收峰后，加95%乙醇至终浓度为75%（体积分数），置4℃过夜，离心取沉淀。沉淀去离子水透析（（MWCO 3500 Da）24 h，醇沉、离心取沉淀，冷冻干燥后溶于适当体积蒸馏水，上SephadexG-100 柱（2.5× 30 cm）,蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚法跟踪检测，收集490 nm 波长吸收峰部分，加95%乙醇至终浓度为80%（体积分数），置4℃过夜，离心取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3 次，冷冻干燥至恒重，得碱提红花蜂花粉总多糖(alkali-soluble polysaccharide from bee pollen of carthamus tinctorius,APBPC)，置玻璃干燥器中备用。

1.4 动物

SPF 级健康昆明种雄性小白鼠，体重18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

2 实验方法

2.1 小鼠分组、造模、给药及检测样品制备

取体重18～22 g 的昆明种雄性小鼠50 只,适应性饲养1 周后，随机分为空白对照组，D-半乳糖衰老模型组及APBPC 低、中、高剂量实验组。实验组每天分别灌胃给与APBPC 100 mg·kg-1，200 mg·kg-1，300 mg·kg-1，空白对照组及D-半乳糖衰老模型组则灌胃等容积生理盐水。在给药的同时,D-半乳糖衰老模型组及APBPC 低、中、高剂量组每天颈背皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1,对照组同法给生理盐水，连续42 天。末次给药后12 h，断头取血，3500 r/m 离心10 min，分离血清置-20℃冰箱保存，在冰浴中迅速剖取肝、脑，并将其置于4℃生理盐水中，洗净表面残留血液，用滤纸吸干，称湿重，按质量与体积比1∶9 加入预冷的生理盐水，冰浴匀浆，离心取上清，制备成10% 的组织匀浆，按试剂盒说明书分别测定血清、肝、脑组织SOD 与GSH-Px 活性及MDA含量。

2.2 数据处理

数据以x± s 表示，用统计软件SPSS19.0进行组间单因素方差分析,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 APBPC 对D-半乳糖所致衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量的影响

结果如表1 所示。结果表明，与正常对照组相比，小鼠给予D-半乳糖后，血清SOD 和GSH-Px 的活性显著降低，MDA 水平明显升高。而给予APBPC 后，能明显拮抗D-半乳糖的作用，使小鼠血清SOD 和GSH-Px 的活性回升，MDA 含量减少，但低剂量APBPC 对GSH-Px 无明显影响（P ＞0.05）。

表1 APBPC对D-半乳糖所致衰老小鼠血清SOD，GSH-Px活性与MDA含量的影响(,n=10)

表1 APBPC对D-半乳糖所致衰老小鼠血清SOD，GSH-Px活性与MDA含量的影响(,n=10)

注：△△表示与正常空白对照组相比，P ＜0.01;＊表示与衰老模型组相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

3.2 APBPC 对D-半乳糖所致衰老小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活性与MDA含量的影响

结果见表2，结果表明，APBPC 能拮抗D-半乳糖的作用，能升高小鼠肝脏SOD 和GSH-Px 的活性，减少MDA 的产生，并呈一定的量效关系。但APBPC 低剂量组对MDA 含量无明显影响（P＞0.05）。

表2 APBPC对D-半乳糖所致衰老小鼠-肝组织SOD,GSH-Px活性与MDA含量的影响(,n=10)

表2 APBPC对D-半乳糖所致衰老小鼠-肝组织SOD,GSH-Px活性与MDA含量的影响(,n=10)

注：△△表示与正常空白对照组相比，P ＜0.01;＊表示与衰老模型组相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

3.3 APBPC 对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织中SOD、GSH-Px 活性与MDA 含量的影响

结果（表3）表明，与衰老模型组相比，APBPC 中、高剂量组均可使脑组织SOD 与GSH-Px 活性明显升高，MDA 含量显著降低。同时，低剂量组APBPC 可使脑组织GSH-Px活性回升，但对SOD 活性及MDA 含量无明显影响（P＞0.05）。

表3 APBPC 对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD、GSH-Px 活性与MDA 含量的影响(-,n=10)

表3 APBPC 对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD、GSH-Px 活性与MDA 含量的影响(-,n=10)

注：△△表示与正常空白对照组相比，P ＜0.01;＊表示与衰老模型组相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

4 讨论

D-半乳糖皮下注射是小鼠衰老造模的常用方法之一。给予小鼠大量的D-半乳糖后，在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖并产生超氧阴离子自由基、过氧化氢等氧化性物质，使活性氧增多，脂质过氧化亢进，对机体造成氧化损害，进而导致机体衰老，其生化和组织结构的改变与自然衰老表现基本吻合[9-10]。自由基的产生和机体对自由基的清除功能的动态平衡同机体的衰老有着密切的关系，MDA 是体内自由基反应的产物，其含量可间接反映体内自由基的多少及反应的强度。而SOD、GSH-Px 是体内最重要的抗氧化酶类之一，在机体抗氧化、抗自由基损伤中起着重要作用。随着年龄的增长，机体清除自由基的能力下降，产生自由基和清除自由基的平衡被破坏，自由基堆积，产生大量代谢产物MDA，对机体产生损害，进而加速机体衰老[9-11]。因此SOD、GSH-Px 含量的高低可以间接反映机体清除自由基的能力，MDA 含量的高低可以间接反映细胞的衰老程度。

实验结果表明，APBPC 能明显拮抗D-半乳糖所致小鼠抗氧化能力的降低，使衰老小鼠的SOD、GSH-Px 的活性回升，并减少MDA的产生，从而增强对氧自由基的清除作用，减少体内氧自由基的产生，改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤。实验结果提示碱提红花蜂花粉多糖（APBPC）具有较好的抗衰老作用，对红花蜂花粉资源的综合利用及深加工具有重要的参考意义。