纳米二氧化钛对水厂生物安全性的影响

刘志远

(上海市政工程设计研究总院〈集团〉有限公司，上海 200092)

随着地表水源水质的恶化以及人们对饮用水水质要求的不断提高，炭砂滤池、臭氧-生物活性炭滤池、生物活性炭滤池和粉末活性炭-微滤/超滤工艺等涉及微生物净化功能的净水技术正逐步被应用于水厂处理过程中[1-2]。通过生物净化作用，可以进一步降低水中有机物和氨氮的浓度，但是，生物净化工艺内的微生物亦会随水流进入后续工艺和出厂水中。如果上述处理工艺内的致病菌丰度增加，特别是一些耐药性强的致病菌的丰度增加，可能导致出厂水中致病菌的浓度超标，影响水厂的生物安全性[3-4]。

纳米二氧化钛是一种被广泛使用的纳米材料。由于其特殊的物理和化学性质，被广泛应用于涂料、塑料、纸、墨水、药品、化妆品、食品、半导体光催化以及太阳能电池中[5]。纳米二氧化钛的广泛应用，必然会逐步渗透到地表水环境当中。Gottschalk等[6]通过暴露模型预测，美国、欧洲以及瑞士地表水中纳米二氧化钛浓度为2～21 ng/L，污水处理厂出水中纳米二氧化钛的浓度为1.75～4.28 μg/L。毒理学研究结果显示：纳米二氧化钛可以影响多种环境中的细菌群落结构。Ge等[7]投加纳米二氧化钛[0.5、1.0、2.0 mg nano-TiO2/(g干土壤)]于土壤中，培养15 d和60 d后，细菌群落结构发生显著改变。Jomini等[8]发现，100 mg/L纳米二氧化钛改变了天然地表水中的细菌多样性，降低了β-变形菌(Betaproteobacteria)和拟杆菌(Bacteroidetes)的相对比例。此外，不同的晶型亦会有不同的毒性。与金红石相比，锐钛矿具有更高的化学活性。Sayes等[9]发现，比例为80∶20的锐钛矿和金红石纳米颗粒(3～5 nm)在经过紫外光照射后，产生的活性氧自由基比单纯金红石多6倍。但是，对于纳米二氧化钛是否会影响水厂水质条件下的致病菌丰度，人们却知之甚少。

本文研究了纳米二氧化钛对水厂水质条件下致病菌丰度的影响。首先从吴江市第一自来水厂分离得到砂滤池表面的微生物。之后，在静态培养条件下，研究纳米二氧化钛对致病菌丰度的影响。试验采用直径为25 nm的锐钛矿晶型二氧化钛，暴露浓度分别为0.1 mg/L和100 mg/L, 菌群结构分析采用454高通量测序，测序位置为细菌16S rRNA的V1～V3可变区。

1 材料和方法

1.1 材料

锐钛矿纳米二氧化钛(产品号：637254)购于美国Sigma公司。

1.2 方法

纳米悬浮液：取适量纳米二氧化钛颗粒分散到超纯水中，配置浓度为100 mg/L纳米悬浮液，之后，用超声处理10 min(25 ℃，250 W，40 kHz)以分散纳米二氧化钛颗粒。

菌液：从吴江市第一自来水厂的砂滤池表层收集滤料2 L，4 ℃下送往实验室，在涡旋振荡仪上振荡10 min(2 800 r/min)，收集上清液，在离心后用0.1%的氯化钠溶液替换上清液(1 000 r/min，20 min)，重复两次，之后，在2 000 r/min下离心1 min，收集上清液。

试验方法：用培养基质稀释菌液至2×108cells/mL。取90 mL菌液均匀地分成9份，置于无菌血清瓶中，投加适量的纳米悬浮液于各份样品中，使纳米颗粒的浓度分别为0、0.1 mg/L和100 mg/L，每份样品重复3次。之后，将所有样品置于摇床内培养12 h(120 r/min，25 ℃，避光)，收集样品并提取DNA。

高通量测序：采用细菌引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’)，以覆盖16S rRNA的V1～V3区域。PCR扩增程序：95 ℃下2 min，循环25次(95 ℃下30 s，55 ℃下30 s，72 ℃下30 s)，最后72 ℃下5 min。每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。然后，将PCR产品提交给上海美吉生物科技有限公司，进行454焦磷酸高通量测序，使用的仪器为454/Roche GS-FLX Titanium Instrument (Roche，NJ，USA)。得到的初始序列首先用roguing process of Qiime进行修剪，用uchime_ref method去除嵌合子，将相似度高于97%的序列聚类成一个分类学单元(OTU)，分类学分析采用Silva数据库(http://www.arb-silva.de)。群落多样性由Chao 1、ACE、Simpson指数、Shannon-Weiner指数和溶解曲线来表示。

致病菌识别：利用人类致病菌毒性因子数据库(VFDB)，链接地址为http://www.mgc.ac.cn/VFs。采用该数据库所列的具有完整信息的30种致病菌进行属一级的致病菌识别。

2 结果和讨论

2.1 对细菌多样性的影响

3个样品的分类学单位数目分别为676、649和630。稀释曲线显示3个样品的曲线均未达到水平，说明进一步提高测序深度可以测得更多OTU。但是，该曲线足以对比细菌的多样性变化。由图1可知,空白样品的曲线最为陡峭，经0.1 mg/L纳米二氧化钛处理的样品曲线次之，经100 mg/L纳米二氧化钛处理的样品曲线最为平缓，表明空白样品具有最高的细菌多样性，随着纳米二氧化钛浓度的增加，菌液的多样性逐步下降。因此，纳米二氧化钛在处理菌液12 h后可以显著降低其多样性。表1中Chao 1、ACE、Shannon-Weiner指数和Simpson指数亦显示了相似的变化趋势。

注：CK、TL和TH分别投加0、0.1 mg/L和100 mg/L纳米二氧化钛图1 细菌分类学单元的稀疏曲线Fig.1 Rarefaction Curves of OTUs

表1 Chao 1、ACE、Shannon-Weiner指数和Simpson指数Tab.1 Chao 1、 ACE、Shannon-Weiner Index and Simpson Index

2.2 对细菌菌落结构的影响

如图2所示，各样品在纲一级的优势分类学单元包括硝化螺菌(Nitrospira)、α-变形杆菌(Alphaproteobacteria)、β-变形菌(Betaproteobacteria)、γ-变形菌(Gammaproteobacteria)以及芽孢杆菌(Bacilli)。TL和TH相比CK，纲一级的分类学组成有显著变化。其中，硝化螺菌和α-变形杆菌的丰度显著下降，而芽孢杆菌和γ-变形菌的丰度显著上升，表明纳米二氧化钛对菌液的菌落结构有显著影响。

注：CK、TL和TH分别投加0、0.1 mg/L和100 mg/L纳米二氧化钛，丰度低于1%的菌种被合并为“其他”)图2 纳米二氧化钛处理后菌液中纲一级分类学组成Fig.2 Taxonomic Compositions of Bacteria across Titanium Dioxide Nanoparticles Treatments at Class I Level

2.3 对致病菌丰度的影响

如表2所示，在3份样品中识别到的致病菌属共11种。TL和TH相比CK，致病菌的总比例显著增加。其中，TL和TH相比CK，不动杆菌、假单胞菌、链球菌以及耶尔森菌的丰度显著增加，表明纳米二氧化钛显著提高了菌液中致病菌的丰度。

表2 属一级的致病菌序列数目Tab.2 Numbers of the Sequences Belonging to the Pathogens across Titanium Dioxide Nanoparticles Treatments at Genus Level

注：CK、TL和TH分别投加0、0.1 mg/L和100 mg/L纳米二氧化钛

3 讨论

不动杆菌是一种革兰氏阴性菌[10]，常见的致病菌种为鲍曼不动杆菌(A.baumannii)，具有较强的耐抗生素性，可以引发肺炎、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染、尿道感染和脑膜炎[11]。假单胞菌属内主要的人类致病菌为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)[12]，可以引发隐形眼镜佩戴者的眼睛感染、烧伤和伤口感染以及囊性纤维化患者的肺部感染[13]。链球菌属含有生脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)[14]。其中，生脓链球菌会引发咽炎、猩红热、脓性血、红疹、蜂窝炎、败血病、毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、风湿热和急性肾小球肾炎等多种疾病，而无乳链球菌会引发新生儿脑膜炎、细菌败血症和肺炎，肺炎链球菌会引发肺炎[12]。耶尔森菌属含有鼠疫杆菌(Y.pestis)、肺结核杆菌(Y.pseudotuberculosis)以及小肠结肠炎菌(Y.enterocolitica)[15]。鼠疫杆菌可以引发黑死病，肺结核杆菌引发肠系膜腺炎和败血症。小肠结肠炎菌可以引发急性肠炎和肠系膜淋巴腺炎等多种胃肠疾病[16]。

需要指出的是，上述致病菌的识别过程是以菌属为单位进行的，同一属内的菌种未必均具有致病性。以假单胞菌属为例，除了常见的致病菌——铜绿假单胞菌[12]，该菌属亦含有非致病菌——恶臭假单胞菌(P.putida)[17]。因此，上述致病菌识别结果仅展现了致病菌丰度增高的趋势以及纳米二氧化钛对生物安全性的影响现象。为了进一步评价纳米二氧化钛对潜在疾病传播的影响，有必要对上述致病菌菌属进行更精细的种间组成分析。为了进行精细的种间组成分析，不建议采用基于16S rRNA的高通量测序，16S rRNA序列在某些物种间差别非常小，加上测序固有的错误率存在，在保证一定取信要求的前提下，难以鉴定到种，因此，需要采用针对性更强的检测技术，例如，定量聚合酶链反应(Q-PCR)、荧光原位杂交技术(Fish)或多点序列分型技术(multilocus sequence typing, MLST)。

由于本试验均在避光的条件下进行，纳米二氧化钛对细菌的毒性机制以膜吸附和细胞内噬为主[18-20]。因此，细胞膜结构可能对其毒性有显著影响。众所周知，不动杆菌、假单胞菌和耶尔森菌均为革兰氏阴性菌，链球菌为革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞膜结构具有显著的差异。但是，本文的试验结果显示，细菌是否对纳米二氧化钛具有抗性作用与其是否为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌无直接关联。因此，上述致病菌在纳米二氧化钛存在时丰度的增加机制仍需要进一步研究。

目前，对美国、欧洲和瑞士地表水中纳米二氧化钛的预测浓度为0.021～16 μg/L[21]。然而，考虑到纳米二氧化钛在过滤时会由于筛滤和吸附作用富集于滤料表面[22]，导致其浓度在滤池内局部迅速升高，故认为0.1 mg/L纳米二氧化钛浓度可能接近某些水厂滤池中纳米二氧化钛的浓度。因此，以上的研究结果表明，当前某些水厂滤池中的纳米二氧化钛浓度足以显著影响其致病菌的丰度。

4 结论

0.1 mg/L和100 mg/L锐钛矿晶型纳米二氧化钛可以显著影响水厂水质条件下的细菌多样性，改变细菌菌落群落，显著提高属一级的致病菌丰度。其中，显著增加的属一级致病菌包括不动杆菌、假单胞菌、链球菌以及耶尔森菌，表明纳米二氧化钛可以显著增加致病菌的丰度，降低水厂的生物安全性。