基于熵权法对千金子-甘草不同配伍比例的化学成分变化及体外肝毒性研究△

张景珍，崔曰新，王思雨，王新杰，张瑶，高慧，兰晓燕，王英姿

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

千金子为大戟科植物续随子EuphorbialathyrisL.的干燥成熟种子，味辛，性温，有小毒；归肝、肾、大肠经；具有泻下逐水、破血消癥，外用疗癣蚀疣的功效；用于二便不通、水肿、痰饮、积滞胀满、血瘀经闭，外治顽癣、赘疣[1]。研究表明千金子中含有多种化学成分，具有广泛的药理活性，常用于治疗白血病、晚期血吸虫病腹水、毒蛇咬伤、膀胱癌、银屑病等疾病[2-4]。甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、 胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎，味甘，性平；归心、肺、脾、胃经；具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功能，在中医临床、方药配伍中应用广泛，有“十方九草”之说，被誉为“国老”“众药之王”。千金子与甘草临床合用报道较多的成药有周氏回生丸(《中华人民共和国药典》一部)，用于霍乱吐泻，痧胀腹痛；时疫救急丸(中药部颁标准)用于暑湿霍乱，头晕发热，脘腹胀痛，恶心呕吐，肠鸣泄泻。目前尚未有关两者配伍后的不良反应数据和报道，且关于两者的配伍研究也极少[5-6]，未见有对其不同配伍比例的研究报道。

“十八反”属于中药“七情”中的相反配伍，为中药用药禁忌的一种，是中药药性理论的重要组成部分，是中药合理用药的重要内容，对指导中药临床用药具有重要意义[7-8]。但“十八反”是否为绝对禁忌，古代文献记载及现代研究均无确切定论，存在一定争议[9-12]。“十八反”中的甘草反海藻、大戟、甘遂、芫花，虽为配伍禁忌但临床应用情况居多，甘草与海藻的配伍多用于治疗瘰疬、瘿证、痹证、肺胀等疾病，而甘草与大戟、甘遂、芫花等药的配伍常用来治疗水肿臌胀、痰饮咳喘等疾病[11，13-15]。文献表明，反药药对在不同剂量配比时，可能会出现毒性的协同、相加或拮抗作用；在适当的配伍组方后，“十八反”药物可能并不是绝对的配伍禁忌[16]。自古以来千金子就与京大戟、甘遂等同列为利水要药，与大戟、甘遂等药性、功效相似，且具有结构相似的二萜类成分，对于甘草与千金子合用时是否存在共性的配伍禁忌规律值得探究。目前，关于甘草与大戟、甘遂、海藻、芫花等配伍的研究居多，而对于甘草与千金子的配伍研究还较少，有待于进一步探究。故本研究是基于“十八反”中的“藻戟遂芫俱战草”，即甘草反海藻、大戟、甘遂、芫花，对千金子与甘草合用进行相关探索研究。

熵权法是一种根据各项指标观测值所提供信息量的大小来确定指标权重的客观赋值方法[17-18]，是客观赋权法的一种，该方法以客观条件为基础，由评价指标来确定指标权重，具有反映数据中隐含信息，增强指标分辨意义、增强指标差异性，避免选用指标的差异过小所造成的数据分析困难，全面反映各类信息等优势。熵权法可避免主观赋权法主观性和不确定性强的弊端，目前在中药的质量控制及工艺优选中已有相关应用[17-23]，将其用于中药多指标综合评价优选中可以有效弥补主观随意性较大的缺陷，对促进中药的研究开发具有重要意义。

本研究选取千金子中的主要毒效成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3[24-26]及甘草中的有效成分甘草苷与甘草酸单铵水合物[27-29]为指标性成分，根据临床应用方剂中甘草与其他中药配伍时最常用配比、周氏回生丸和时疫救急丸中两者配比以及《中华人民共和国药典》中两者的规定剂量，选取甘草-千金子的配伍比例分别为1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1。基于大戟科中药多具肝肾毒性[30-34]，拟通过不同配伍比例中的指标成分变化及肝细胞毒性实验，利用熵权法对甘草-千金子不同配伍比例进行综合评分优选，探讨两者合用甘草对千金子肝细胞毒性的影响，为甘草、千金子临床应用组方及进一步研究提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国赛默飞高效液相色谱仪；Chromeleon®变色龙色谱数据系统；BSI10型万分之一电子天平(德国赛多利斯集团)；KH7200DB型数控超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)；Research plus 单道可调量程移液器(德国Eppendorf)；倒置相差显微镜(奥林巴斯有限公司)；细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司)；生物安全柜(海尔集团)；荧光分光光度计、酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；离心机(德国Eppendorf)；Milli-Q 纯水机(Millipore)。

1.2 试药

千金子饮片购自安徽亳州沪谯中药饮片厂(批号：1203070692，产地：江西)，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为大戟科植物续随子E.lathyrisL.的干燥成熟种子，甘草饮片购自北京仟草中药饮片有限公司(批号：180706013，产地：新疆)，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为豆科植物甘草G.uralensisFisch.的干燥根和根茎。对照品千金子素L1(批号：111789-200901，纯度：99.3%)、千金子素L2(批号：111790-200901，纯度：98.5%)、千金子素L3(批号：111791-200901，纯度：98.6%)购于中国食品药品检定研究院；对照品甘草苷(批号：551-15-5，纯度：94.2%)和甘草酸铵(批号：53956-04-0，纯度：94.2%)购于上海诗丹德标准技术服务有限公司。细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；培养基、血清、胰酶、双抗、PBS均购自赛默飞世尔科技有限公司；实验用水为超纯水；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

1.3 细胞株

LO2细胞来源于中国科学院生物物理研究所。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

精密称取千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3对照品适量，加甲醇溶解，配制成1.032 mg·mL-1千金子素L1、1.026 mg·mL-1千金子素L2、1.012 mg·mL-1千金子素L3的对照品储备液。

精密称甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加70%乙醇水溶解，配制成1.026 mg·mL-1甘草苷、1.014 mg·mL-1甘草酸铵的对照品储备液。

2.2 供试品溶液的制备

按1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1比例取甘草(过四号筛)-千金子(适当粉碎)共1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90 mL 70%乙醇水，称质量，超声处理25 min(功率 250 W，频率 50 kHz)，放冷，称质量，补足减失质量，0.45 mm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

按1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1比例取甘草(过四号筛)-千金子(适当粉碎)共1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90 mL 70%乙醇水，称质量，超声处理25 min(功率250 W，频率50 kHz)，放冷，称质量，补足减失质量，抽滤，减压回收乙醇，60 ℃真空干燥浓缩成浸膏。精密称取不同配伍比例药物浸膏各50 mg，分别加入10 mL 磷酸缓冲液(PBS)溶解，得不同配伍比例的药物溶液(5 mg·mL-1)，再稀释成不同比例的药物溶液(50 mg·mL-1)。配制好的各供试品溶液用0.22 mm的滤膜过滤，备用。

2.3 色谱条件

2.3.1 千金子含量测定色谱条件 色谱柱：ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A)；检测波长：275 nm；流速：1 mL·min-1；温度：25 ℃；进样量：20 mL。

2.3.2 甘草含量测定色谱条件 色谱柱：ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%的磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～8 min，18%A；8～20 min，18%～30%A；20～30 min，30%～50%A；30～31 min，50%～100%A；31～35 min，100%～18%A；35～45 min，18%A)；检测波长：237 nm；流速：1 mL·min-1；温度：35 ℃；进样量：20 mL。

在上述色谱条件下检测对照品溶液、甘草单煎液、千金子单煎液、甘草-千金子合煎液，HPLC图见图1～2。

2.4 细胞培养

将解冻复苏的LO2肝细胞培养于DME(含10%胎牛血清和1%双抗)培养基中，置于37 ℃、5%CO2、70%～80%湿度的细胞培养箱中培养。待细胞密度达80%～90%，即按1∶4的比例进行细胞传代，每隔1 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1项下配制的千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，稀释得系列浓度的各对照品溶液。按2.3项下色谱条件进样分析，计算得线性回归方程见表1，结果千金子素L1在5.16～103.20 mg·mL-1、千金子素L2在1.03～51.30 mg·mL-1、千金子素L3在5.06～101.20 mg·mL-1、甘草苷在2.05～205.20 mg·mL-1、甘草酸铵在10.14～608.40 mg·mL-1峰面积与浓度线性关系良好。

注：A.千金子素L1、L2、L3混合对照品；B.千金子单煎；C.千金子-甘草合煎；1.千金子素L1；2.千金子素L2；3.千金子素L3。图1 千金子素L1、L2、L3 HPLC图

注：A.甘草苷、甘草酸铵混合对照品；B.甘草单煎；C.千金子-甘草合煎；1.甘草苷；2.甘草酸铵。图2 甘草苷、甘草酸铵HPLC图

表1 甘草与千金子中各指标成分的线性关系考察结果(n=6)

2.5.2 精密度试验 取2.1项下配制的对照品溶液，按2.3项下色谱条件测定，进样20 mL，测定峰面积值，连续进样6次，计算千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.19%、0.25%、0.26%、0.32%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取2.2项下制备的供试品溶液，按2.3项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h，进样20 mL，测定峰面积值，计算千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸铵的RSD分别为1.53%、0.36%、0.68%、0.40%、0.32%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 按2.2项下供试品溶液的制备平行制备6份供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样20 mL，测定峰面积值，计算得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷、甘草酸铵的RSD分别为0.56%、1.58%、0.21%、0.61%、0.95%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称量已知含量的甘草-千金子(1∶1)粉末，平行6份，精密加入与样品中含量相当的对照品，按2.2项下制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。

2.6 样品成分溶出率测定

取2.2项下制备的各供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样20 mL，测定峰面积值，计算各成分溶出率，结果见表3。

2.7 CCK-8法测定甘草与千金子不同配伍比例对LO2细胞的毒性

取对数生长期的细胞，消化后接种于96孔板中，每孔接种5000个细胞，将96孔板在培养箱中培养过夜。实验组按50 mg·mL-1的药物质量浓度和千金子∶甘草(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶0、0∶1)药物配伍对细胞进行处理，每组设置5个平行，处理48 h，处理结束后弃去含药培养液，向每孔中加入CCK8溶液(每孔100 mL加入10 mL CCK8)。实验同时设置空白组(加入相应量的培养基和CCK8溶液，不加细胞和药物)和对照组(加入相应量的培养基、CCK8溶液和细胞，不加药物)，5个平行。在37 ℃孵育1 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)。根据测得的A值按公式(1)计算细胞相对存活率。

表2 甘草和千金子中各指标成分的加样回收率试验结果 %

(1)

2.8 细胞形态学观察

取对数生长期的细胞消化后接种于96孔板中，每孔接种5000个细胞，将96孔板在培养箱中培养过夜。实验组按50 mg·mL-1的药物质量浓度和千金子∶甘草(4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶0、0∶1)药物配伍对细胞进行处理，培养48 h后，放置于倒置显微镜下观察 LO2 细胞形态及生长情况并拍照。

2.9 数据分析

2.9.2 熵权法客观赋权 1)数据标准化：假设给定了K个指标X1，X2……XK，其中Xi={x1，x2……xn}。假设对各指标数据标准化后的值为Y1，Y2……YK，那么Yij=(Xij-min(Xi))/(max(Xi)-min(Xi))。2)求各指标的信息熵Ej：Ej=-ln(n)-1。其中pij=Yij/，如果pij=0，则定义。3)确定各指标权重Wi：Wi=(1-Ei)/(k-∑Ei)(i=1，2……k)。

3 结果

3.1 甘草与千金子不同配伍比例中各成分溶出率测定结果

对甘草与千金子不同配伍比例的供试品溶液进行测定，各指标成分的溶出率测定结果见表3。由实验结果可知甘草与千金子以不同比例配伍后对甘草苷、甘草酸铵、千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3等主要指标成分的溶出率有不同程度的影响，提示甘草与千金子配伍后毒效作用的改变可能与其主要化学成分的变化有关。

3.2 甘草-千金子不同配伍比例正常肝细胞LO2的相对存活率

用CCK-8法测定甘草-千金子不同配伍比例对正常肝细胞LO2的毒性作用，由结果可知随着配伍比例中甘草比例的增加，细胞的相对存活率增加，说明甘草对细胞的存活有积极作用，结果见表4。

表3 甘草与千金子不同配伍比例中各指标成分的溶出率测定结果

表4 甘草与千金子不同配伍比例对正常肝细胞LO2的增值抑制率

3.3 细胞形态学检测

倒置显微镜下观察，甘草单提组细胞生长良好，大小均一，细胞数目与空白组无明显差别，而千金子单提组、甘草-千金子不同配伍比例组细胞存在不同程度的皱缩，细胞数目有不同幅度的减少，其中以千金子单提组与甘草单提组和空白组差别最大，说明甘草对细胞生长基本无影响，千金子可明显抑制细胞的生长影响细胞凋亡；与千金子组比较，两者以不同比例配伍后各组可减少细胞的凋亡数目，结果见图3。

注：A.空白组；B.甘草组；C.千金子组；D.甘草-千金子(4∶1)；E.甘草-千金子(2∶1)；F.甘草-千金子(1∶1)；G.甘草-千金子(1∶2)；H.甘草-千金子(1∶4)；比例尺=1000 μm。图3 各组LO2细胞形态图

3.4 甘草与千金子中各指标成分与细胞的相对存活率相关性分析

将指标成分千金子素L1、L2、L3，甘草苷和甘草酸铵的含量分别与细胞相对存活率做相关性分析，结果表明千金子素L1、L2、L3与细胞相对存活率呈负相关，甘草苷、甘草酸铵与细胞相对存活率呈显著正相关，结果见表5。

表5 甘草和千金子中各指标成分与细胞相对存活率的相关性结果(n=7)

注：*P<0.05。

3.5 熵权法计算得各指标成分权重及不同比例得分

采用熵权法计算各指标成分的权重，并对甘草-千金子不同配伍比例进行综合评分比较，结果千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、甘草苷和甘草酸铵的权重依次为0.30、0.22、0.18、0.17和0.12，甘草-千金子4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4各配伍比例的得分依次为2.97、2.75、2.99、2.71和2.82，得到综合评价排序为1∶1、4∶1、1∶4、2∶1、1∶2。

4 讨论

中药本身成分较多，而配伍后的成分更为庞杂，药物间的相互关系也异常复杂。本实验通过对甘草-千金子不同配伍比例下主要化学成分的变化进行研究，初步探讨甘草-千金子配伍变化的物质基础，结果表明甘草与千金子以不同比例配伍后甘草苷、甘草酸铵、千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3等主要指标成分的溶出会发生不同的变化，甘草苷与甘草酸铵相对于甘草单提组溶出率增加，而千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3相对于千金子单提组普遍减小，提示其有效成分的变化可能与配伍前后毒效作用不一有关。此外，用CCK-8法从细胞形态学和细胞活力角度测定甘草-千金子不同配伍比例对正常肝细胞LO2的毒性作用，发现千金子单药对正常肝细胞LO2有抑制作用，甘草与千金子配伍后可减轻千金子的细胞抑制作用，且随着配伍比例中甘草比例的增加减缓作用增强。通过相关性分析并利用熵权法计算各指标成分的权重及对不同配伍比例进行综合评分，得甘草与千金子配伍比例1∶1时综合评分最高，即基于化学成分变化及体外细胞毒性研究得两者的最佳配伍比例为1∶1时可有效降低千金子的体外肝细胞毒性作用。

“十八反”为中药配伍禁忌的主要内容，但两相反药物配伍使用在古代中医方剂和现代临床中均有相应的应用。综上所述，本实验基于中药“七情”配伍规律，从物质基础及细胞角度对甘草-千金子不同配伍比例的化学成分及体外细胞毒性进行研究，结合客观性较强的熵权法对其配伍比例进行综合评分优选，初步对甘草-千金子不同比例配伍进行了研究，为其他药物配比的研究提供新的研究思路与方法。本实验数据处理时，采用熵权法对各权重指标进行客观赋权，与主观赋权法相比，权重数据完全来源于实验所得数据的整理、计算与分析，其得到的权重系数可靠性更高，可以客观地反映出实际数据的内在规律，从而对实验结果做出客观评价，使实验结果更准确[35-36]。仅有的2篇文献报道表明，千金子与甘草合用在肠黏膜损伤方面能够体现“增毒”的配伍禁忌现象，而在肠屏障功能、肠道运动调节功能及系统炎症方面未见配伍前后的显著差异[5-6]。本实验结果表明，在适当的比例配伍组方后，“十八反”药物可能并不是绝对的配伍禁忌，这与自古至今均有“十八反”同用的情况相符，前期甘遂、大戟等与甘草配伍的研究也出现毒性减弱的情况[37-38]，体现出甘草“清热解毒，调和诸药”的性质。分析原因有以下几个方面，一是药物提取方式的不同，本实验中千金子与甘草的提取方式为合提，而此前文献报道中的药物为单味药提取后合并使用及单味药物提取物与单体成分的混合使用；二是本实验是基于化学成分及细胞实验的体外研究，文献报道的研究是基于实验动物的体内研究；三是药物比例不同，本实验中千金子-甘草的配伍比例与文献中的不同。综上所述，千金子-甘草配伍受药材品质、炮制方法、配伍比例、药物剂型及机体等多种因素影响且作用机制复杂，故需要从体内外物质基础变化、量-效-毒关系、成分-靶点-通路等方面对千金子-甘草的配伍作用机制进行深入探讨，以期能科学、客观地评价两者配伍应用，并为两者临床合理安全用药提供理论依据。