天花粉(栝楼)标准汤剂的UPLC指纹图谱研究

陈锦霞，史紫娟，陈伟钢

国药集团 广东环球制药有限公司，广东 顺德 528303

天花粉为葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.或双边栝楼T.rosthonii Harms.的干燥根[1]，为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品，性微寒，味甘、微苦。具有清热泻火，生津止渴，消肿排脓的作用，多用于热病烦渴、肺热燥咳、内热消渴、疮疡肿毒。现代研究发现，天花粉主要具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒等作用，临床常用于妇科引产、消渴证、艾滋病治疗，外用治疗红肿热痛等皮肤证[2-6]。天花粉(栝楼)标准汤剂是由天花粉(栝楼)药材经炮制、提取、过滤、浓缩、干燥制备而成。

指纹图谱技术作为一种综合的、可量化的鉴定手段，近年来被广泛应用于中药材以及中药制剂成品的质量控制与评价。本研究采用超高效液相色谱法(UPLC)建立天花粉(栝楼)标准汤剂指纹图谱，为制定天花粉(栝楼)配方颗粒质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(沃特世公司)；MS105DU十万分之一天平、AL104万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；MILLIPORE Synergy UV超纯水系统(默克股份有限公司)；YMW机械分体煎药壶(深圳一枚王有限公司)；TRL-0.5真空冷冻干燥机(大连双瑞科技有限公司)；YRE-2000B旋转蒸发仪、SHZ-DШ循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DLSB-5/20低温冷却液循环水泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药

天花粉对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121361-201603)；柠檬酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111679-201602)；磷酸、甲酸、乙腈、甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；水为超纯水；16批天花粉标准汤剂(样品编号为S1～S16)。

天花粉药材经国药集团广东环球制药有限公司中级工程师邓明生鉴定，除THF17批为天花粉(双边栝楼)外，其余批次均为天花粉(栝楼)。

1.3 药材

参考2015年版《中华人民共和国药典》天花粉项下炮制方法制成天花粉饮片[1]，药材具体信息见表1。

表1 天花粉药材信息

2 方法与结果

2.1 天花粉(栝楼)标准汤剂的制备

以国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》为依据，制备天花粉标准汤剂。取天花粉饮片100 g，置于砂锅中，加水煎煮2次。第一次煎煮加9倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁热过350目筛网滤过，滤液迅速冷却，备用；二煎加饮片量7倍水，武火煮沸后，文火煎煮15 min，趁热过350目筛网滤过，滤液迅速冷却。合并2次滤液，65 ℃减压浓缩，浓缩至约200 g，冷冻干燥，即得。天花粉标准汤剂信息见表2。

表2 天花粉标准汤剂批号

2.2 色谱条件

CORTECS T3色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～5 min，0%A；5～18 min，0%～45%A；18～20 min，45%～90%A；20～25 min，0%A)；流速为0.2 mL·min-1；检测波长为220 nm；柱温为30 ℃。

2.3 对照品溶液的制备

取天花粉对照药材约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水25 mL，称定质量，超声处理30 min(功率：500 W，频率：40 KHz)，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，离心，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得(临用新制)。另取柠檬酸对照品适量，精密称定，加水溶解，制成每1 mL含0.4 mg的溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加水适量，超声处理10 min(功率：500 W，频率：40 kHz)，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一批号(S6)天花粉(栝楼)标准汤剂，按2.4项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按2.2项下条件测定。以柠檬酸(峰1)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(S6)，分别在0、4、6、8、10、12、16、20、24 h进样，进样体积为1 μL。以柠檬酸峰(峰1)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取同一批号样品(S8)，分别精密称取6份，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，分别进样1 μL，以柠檬酸峰(峰1)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均小于2%，表明本方法重复性良好。

2.6 天花粉(栝楼)标准汤剂UPLC指纹图谱的建立

2.6.1 15批天花粉(栝楼)特征图谱的测定 分别精密吸取2.4项下制备的各批次供试品溶液1 μL，注入液相色谱仪，按照2.2项下色谱条件进行测定。结果见图1。

图1 15批天花粉(栝楼)标准汤剂的UPLC叠加图

2.6.2 天花粉(栝楼)标准汤剂对照指纹图谱的建立 采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对15批天花粉(栝楼)标准汤剂UPLC图谱进行处理，自动校正后进行色谱峰匹配，匹配结果见图2。以1号峰柠檬酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。见表3～4。15批天花粉标准汤剂与对照指纹图谱相似度分别为0.923、0.988、0.971、0.996、0.993、0.975、0.988、0.997、0.998、0.985、0.993、0.961、0.989、0.990、0.979。

表3 15批天花粉(栝楼)标准汤剂指纹图谱(相对保留时间)

2.7 天花粉标准汤剂不同基原(栝楼和双边栝楼)指纹图谱的区别

取天花粉(双边栝楼)标准汤剂S16，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件测定，其指纹图谱测定结果与天花粉(栝楼)标准指纹图谱对比见图3。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

采用PAD检测器对样品进行全波长扫描，通过对比不同检测波长色谱图发现，当检测波长为220 nm时，天花粉标准汤剂色谱峰最多，且各色谱峰的响应值均较高，因此选择220 nm为检测波长。另考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸4种流动相的分离效果，结果，在甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱下，色谱图基线平稳，色谱峰分离度良好。

以峰1柠檬酸峰为参照峰，15批天花粉标准汤剂指纹图谱的其余3个特征峰相对保留时间RSD为0.18%～0.53%，均小于2.0%。

3.2 指纹图谱的评价

本研究标示了天花粉(栝楼)标准汤剂的4个共有峰，并通过相似度评价软件计算出15批天花粉标准汤剂的对照图谱的相似度，结果均大于0.90。各批次天花粉(栝楼)标准汤剂的图谱整体上基本一致，能够全面提供质量信息，本研究所建立的方法可为天花粉(栝楼)配方颗粒的质量控制与评价提供参考。