链霉菌PTY-3 产绿色素的发酵条件优化

刘最，李玉中，何丽芳

（衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008）

色素即着色剂，被广泛应用于食品、医药、化妆品、印染等工业。通常分为合成色素和天然色素两大类。由于合成色素色泽鲜艳、着色力强、价格低廉，性质稳定，被广泛使用。随着人们安全意识的增强，对食品要求也愈发提高，陆续有研究发现合成色素具有一定的慢性毒性和致癌性[1-2]。与之相比，天然色素源于自然，安全性高、且无毒无副作用。同时，天然色素不仅具有一定的营养价值，还具有良好的保健和药用功能，如番茄红素有利于降低得癌症和心血管病等慢性病的机率[3]；姜黄素具有抗诱变、抗肿瘤、抗氧化、降血脂和抗动脉粥状硬化，以及抗炎、抗凝、抗感染、防止老年斑的形成等多种生理功能[4]；花青素具有抗氧化、清除自由基的作用，并兼具抗癌、降血压、软化血管等方面的功能性[5]；虾青素具有强抗氧化、抗炎症、免疫力调节、抗肿瘤等多种药理学作用[6-7]；灵菌红素具有提高白细胞活性，促进其吞噬效应或者诱导人类结肠癌细胞凋亡的作用[8-9]。已逐渐取代合成色素，在世界范围内受到积极开发。微生物色素作为一种天然色素，具有易于培养，发酵周期短，不受季节、空间和环境影响等优于动植物色素的多种特点[10-11]。因此，利用微生物发酵生产天然色素具有广阔的应用前景。目前，利用微生物生产天然色素的种类较多，研究主要集中在蓝色素、红色素、紫色素、黄色素等[12-15]。而关于绿色素的研究主要是植物资源，如：芹菜、菠菜、绿茶等，对通过微生物发酵生产绿色素的报道却甚少。

放线菌作为一类具有重要经济价值的微生物资源，广泛存在于不同的自然生态环境之中，与人类关系极其密切。它可以产生多种抗生素及包含维生素、酶抑制剂、免疫调节剂、抗寄生虫剂和天然食用色素在内的多种非抗生素类活性物质[16]。本研究以分离自吉林省四平市大棚黑土中的一株链霉菌PTY-3 作为实验材料，通过发酵培养，研究多种单因素对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响，以及在单因素的基础上利用正交试验法对链霉菌PTY-3 高产绿色素的培养条件进行优化，为其产绿色素进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

从吉林省四平市大棚黑土样品中分离纯化得到编号为PTY-3 的链霉菌菌株，由衡阳师范学院生命科学与环境学院南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室保存。

1.2 培养基

均采用高氏一号培养基[17]。

1.3 仪器与设备

BSD-yx2200 博讯智能精密摇床 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-BSH-III 生化培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-2102 PCS 型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；SB-5200D 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株的培养

挑取适量的孢子，接种于装有高氏一号液体培养基的250 mL 三角锥形瓶中， 于28 ℃，200 r/min，摇床培养24 h 后，再接种至摇瓶液体发酵培养液中，28 ℃，200 r/min，恒温培养7 d。

1.4.2 色素检测方法

将发酵液于5000 r/min 离心15 min，弃去上清液，得绿色菌体。在恒温鼓风干燥箱中烘干至恒重，准确称取一定量0.1 g 菌体于研钵中研磨成粉末，加入10 mL 无水乙醇，震荡混匀，静置2 h后，进行超声提取，离心得绿色素浸提液，浓缩为绿色素粗提物[18]，待用。

色素效价定义[19]：每毫升发酵液所提取的色素，在最大吸收波长处测得的吸光度为0.1， 定义为1 个色价(U/mL)。

1.4.3 最大吸收波长的测定

将绿色素浸提液稀释适当倍数，用UV-2102 PCS 型紫外可见分光光度计进行光谱扫描，以提取剂乙醇为空白对照，选取扫描波长为190-910 nm，确定其最大吸收波长。

1.4.4 单因素试验

(1)初始pH 值对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响

以种子培养基作为基础发酵培养基，控制装液量为100 mL，接种量为10 %，发酵温度为28 ℃，发酵时间为7 d，调节培养基的初始pH 值分别为5.5、6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 和8.5，以色价作为测量指标，观察初始pH值对色素产生的影响。

(2)装液量对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响

以种子培养基作为基础发酵培养基，调节pH值为7.5，设置摇瓶的装液量分别为50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL、120 mL，其它发酵条件同上，以色价作为测量指标，观察装液量对色素产生的影响。

(3)接种量对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响

以种子培养基作为基础发酵培养基，设置装液量为100 mL，控制摇瓶的接种量分别为2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、14 %，其它发酵条件同上，以色价作为测量指标，观察接种量对色素产生的影响。

(4)发酵温度对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响

以种子培养基作为基础发酵培养基，控制接种量为10 %，调节发酵摇床的培养温度分别为24 ℃、26 ℃、28 ℃、 30 ℃、32 ℃和34 ℃，其它发酵条件同上，以色价作为测量指标，观察发酵温度对色素产生的影响。

(5)发酵时间对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响

以种子培养基作为基础发酵培养基，调节摇床培养温度为28 ℃，发酵培养时间分别为5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d，其它发酵条件同上，以色价作为测量指标，观察发酵时间对色素产生的影响。

1.4.5 正交试验设计

以绿色素的色价为指标，分别研究了5 个因素对链霉菌PTY-3 发酵培养产绿色素能力的影响。在此基础上，采用正交试验法对发酵条件进行优化，数据结果运用excel2007 处理。

2 结果与分析

2.1 菌株形态观察

如图1 所示，菌株PTY-3 在高氏一号培养基上生长良好，24 h 后可见白色菌落，并伴有少量绿色素的产生。随着时间的增加，菌落形态增大且绿色素产量增加。菌落干燥，表面呈致密的丝绒状，与培养基连接紧密，难以挑取。正反面颜色不一致，气生菌丝为灰白色，基内菌丝呈现绿色。

2.2 最大吸收波长的确定

将菌株接种于高氏一号液体培养基培养7d后，利用超声波法提取的绿色素溶液（乙醇为溶剂）如图2 所示。

图2 菌株产生的绿色素

以提取剂乙醇为空白对照，选取扫描波长为190-910 nm，绿色素的吸光特性见图3。经测定发现，该绿色素溶液在波长为214 nm 处出现最大吸收峰。

图3 超声波法提取的色素溶液光谱扫描

2.3 单因素对绿色素产生的影响

2.3.1 初始pH 值对产绿色素的影响

图4 初始pH 值对产绿色素的影响

由图4 可知，随着pH 的升高，绿色素产量先增加后减少，发酵起始pH 值在5.5～7.5 范围内，绿色素的产量随pH 值的增大而增加。pH 为7.5 时，绿色素的产量达到最高。pH 值超过7.5 之后，菌体的生长和产物的合成均受到一定的抑制，绿色素的产量随着pH 值的增大而出现下降的趋势。微生物在不同的生长阶段和不同的生理生化反应过程中有不同的最适pH 要求，因而在不同的pH 值条件下积累的代谢产物也会有所不同。结果表明在偏酸和偏碱的环境条件下，会影响酶的活性和微生物的代谢过程，也会影响微生物对物质的利用情况，从而导致绿色素产量下降。因此最佳初始起始pH 值为7.5 时最有利于绿色素的合成。

2.3.2 装液量对PTY-3 产绿色素的影响

图5 装液量对产绿色素的影响

装液量在一定程度上反映了发酵液的溶氧量。链霉菌是好氧型生物，在液体发酵培养过程中，适量的溶解氧不仅可以促进菌株呼吸代谢的进行，还有利于代谢产物色素的合成。由图5 可知，随着装液量的增加，绿色素的产量先缓慢增加再急剧下降。装液量在50-100 mL 内， 随着摇瓶装液量的增加，绿色素的产量随之增加。在装液量为100 mL 时达到最高，继续增加装液量绿色素产量则急剧下降。这是因为装液量少、营养成分少，不利于绿色素的合成，产量则低；随着装液量的不断增加，溶氧水平下降，不利于于菌体的生长。同时，代谢途径可能会发生改变，产生其它类型的副产物，故绿色素的产量则呈不断下降的趋势。因此250 mL 的三角瓶装液量为100 mL最有利于绿色素的合成。

2.3.3 接种量对PTY-3 产绿色素的影响

图6 接种量对产绿色素的影响

接种量的大小决定菌株在液体发酵过程中的生长繁殖速度，会影响代谢产物的合成。由图6 可知，接种量为2 %～14 %过程中，随着接种量的增加，绿色素产量呈先增加后下降的趋势。 接种量在2 %～10 %内，绿色素产量随接种量的增加而提高。在接种量为10 % 时达到最高，当接种量大于10 %时，绿色素的产量开始下降。原因在于，接种量过小，菌数增长缓慢，会延长培养时间，降低发酵效率，同时也会降低菌种活力。接种量过大，培养液粘度增加，引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济。适宜的接种量可以缩短微生物的适应期，使之快速进入对数期，因此接种量为10 % 最有利于绿色素的合成。

2.3.4 发酵温度对PTY-3 产绿色素的影响

图7 发酵温度对产绿色素的影响

由图7 可知，发酵温度在24～34 ℃内，绿色素产量随着温度的升高先增加再下降。即当发酵温度为24～28 ℃时，绿色素产量随着温度的升高而不断增加。在28 ℃时，绿色素产量达到最高。温度过高时，绿色素产量呈下降趋势。原因可能是温度不仅对微生物的酶促反应速率和代谢调节途径产生一定的影响，还可能会影响产物合成方向和发酵液的理化性质（溶解氧的溶解度，基质的分解和吸收速率、营养浓度等），最终导致绿色素的产量发生变化。因此发酵温度为28 ℃最有利于绿色素的合成。

2.3.5 发酵时间对PTY-3 产绿色素的影响

图8 发酵时间对产绿色素的影响

由图8 可知，发酵时间在5 ～8 d 内，绿色素的产量随着培养时间的延长而增加。达到8 d 后绿色素的产量不再增加，达到最高值。继续延长发酵时间，绿色素的产量呈下降的趋势。因为绿色素是发酵过程中的代谢产物，在发酵前期，主要是菌体的自我增殖，色素没有产生，当菌体量不再增加时，则开始积累代谢产物。当发酵达到一定时间，菌体的部分死亡使发酵液成分发生变化，会引起pH 改变，从而影响色素的产生。所以发酵达到8 d 时绿色素含量达到最高。发酵时间超过8 d 后，次级代谢产物绿色素可能会发生某种程度上的降解或者转变为其它产物，因而绿色素产量不断减少。因此最佳发酵时间为8 d 最有利于绿色素的合成。

2.4 正交试验及验证

在以上单因素试验结果的基础上，按照表1 设计5 因素4 水平的正交试验[20]，对其发酵培养条件进行优化。

表1 正交试验因素水平

由表2 的极差分析可知，5 个因素对绿色素的色价影响大小顺序依次为装液量＞接种量＞发酵时间＞发酵温度＞起始pH 值。由表3 的方差分析可见，4 个因素均不显著( p＞0.05)。因素D 在统计学上有显著影响，而因素A、B、C 和E 没有显著影响。综合分析，链霉菌PTY-3 产绿色素的最佳发酵条件组合为A2B2C2D3E2，即发酵时间8 d，发酵温度为28 ℃，接种量为10%，装液量110 mL/250 mL和发酵起始pH 值为7.5。

根据优化所得的最佳发酵条件组合，进行验证实验。绿色素平均产量为77.0 U/m L，基本符合预期值，绿色素产量相比优化前提高了34.4 %，由此可见，不同培养条件之间存在一定的协同作用，对其优化后明显提高了色素的产量。正交试验优化所得组合A2B2C2D3E2，可以作为链霉菌PTY-3 产绿色素的最佳发酵条件。

表2 绿色素产量的正交试验设计与结果

表3 方差分析

3 结论与讨论

本实验以一株产绿色素的链霉菌作为实验菌株，分别研究了发酵时间、发酵温度、接种量、装液量和发酵起始pH 值对链霉菌PTY-3 产绿色素的影响。在单因素试验的基础上，优化了该菌株产色素的发酵条件。在最佳发酵条件下，绿色素产量高达77.0 U/m L，是未优化前的1.34 倍。然而，该研究只是停留在实验室阶段，若要利用发酵罐加大培养的话，期间可能会遇到很多问题，下一步需以优化后的发酵条件为前提，通过利用基因工程手段得到编码色素合成酶的相关基因，构建微生物色素生产工程菌，并对其代谢途径进行有效调控，就有可能实现色素的工业化生产。

对于该菌株的分类地位尚未研究，需结合16S rRNA 序列分析进行确定。目前有关放线菌产绿色素的研究甚少，所以该菌株具有很好的应用前景。为此，后续需要进一步对绿色素的安全性、稳定性及生物活性等方面进行研究，并且采用化学分析测试方法对其结构进行研究比较，为该色素在食品、医药、化妆品、印染等方面的应用提供有益探索。