金香颗粒预防小鼠大肠杆菌性腹泻的效果观察

赵宝凯 ， 耿 健 ， 钟 灵 ， 曹俊杰 ， 杨汉春

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京大伟嘉生物技术股份有限公司 ， 北京 海淀 100085 ； 3. 吉林大学动物科学院 ， 吉林 长春 130062)

在规模化猪场中腹泻导致仔猪死亡数量占疾病引起仔猪死亡的20%[1-2]，大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原菌。在仔猪大肠杆菌性腹泻的防治中普遍采用抗菌药物、激素、化学合成药物，这些药物的长期使用极易产生耐药性及造成药物残留风险。已有中药用于治疗仔猪的大肠杆菌性腹泻并取得满意效果[3]。金香颗粒是通过现代化的制剂技术将传统金香散原方制备成了一种利于规模化生产和临床使用的颗粒剂，提高临床治疗效果与使用方便性。本试验通过分析金香颗粒对小鼠大肠杆菌性腹泻的预防效果来评价金香颗粒的药效作用，阐明其作用机理，为其用于防治仔猪腹泻的临床应用提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠，体重(20±2) g，雌雄各半,购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号:SCXK(辽)2010-0001。分笼饲养，自由饮水，饲喂颗粒料。

1.1.2 药物与主要试剂 金香颗粒[沈阳伟嘉牧业技术有限公司，将金丝桃苷、蜘蛛香两味药的提取清膏与石菖蒲细粉，与蔗糖粉和糊精(3∶1)的混合物为稀释剂，利用湿法制粒法制备而成]，批号：20170217；白头翁散(沈阳嘉伟牧业技术有限公司)，批号：20170227；氯化钠注射液(四平巨能药业有限公司)，批号：160711；依文思蓝(上海源叶生物有限公司)，批号：M26S6L3204。小鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，批号：20170907；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)，批号20170313。

1.1.3 试验菌种 猪源致病性大肠杆菌O101，菌株为CVCC231，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 引起小鼠腹泻的大肠杆菌菌数确定 参照文献[4]，用5个不同菌液数量进行感染模型的建立。选取试验鼠30只，雌雄各半，随机分为6组，每组5只，小鼠腹腔注射0.6 mL的大肠杆菌菌悬液，分别给菌1×109、7×108、5×108、3×108、1×108CFU(菌落形成单位)，空白组腹腔注射0.6 mL 生理盐水作为对照。在注射4 h后，统计各组腹泻率与死亡率。

1.2.2 试验分组及处理 选取60只小鼠，雌雄各半，随机平均分为6组，分别为高剂量组灌服金香颗粒3.2 g/(kg·bw)、中剂量组灌服金香颗粒1.6 g/(kg·bw)、低剂量组灌服金香颗粒0.8 g/(kg·bw)、药物对照组灌服白头翁散0.64 g/(kg·bw)、感染不给药组(生理盐水)和空白对照组(生理盐水)，每组10只小鼠。分别对金香颗粒用药组和药物对照组小鼠进行预防性给药，每只灌服0.5 mL相应浓度的药物混悬液，1 次/d，连续5 d；感染不给药组和空白对照组，每只灌服生理盐水0.5 mL，1 次/d，连续5 d。末次给药30 min后，各组小鼠腹腔注射5×108CFU大肠杆菌O101菌液，0.6 mL/只，空白对照组注射同体积的无菌培养基。

1.2.3 金香颗粒对小鼠大肠杆菌腹泻模型的效果 在小鼠腹腔注射大肠杆菌后，统计各组小鼠的稀便次数、总便次数、稀便大小，计算出稀便率、稀便级和腹泻指数。

稀便级：稀便的程度，以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小分为 4 级。直径<1 cm为1级，1～<2 cm 为2级，2～<3 cm为3级，≥3 cm为4级。污迹为较规则圆形者测其直径，不规则形状则测量其最长和近似圆的直径的平均数。

腹泻指数=稀便率×平均稀便级

1.2.4 病理组织学观察 在腹腔注射大肠杆菌4 h后，处死、剖检，取小鼠小肠组织，经 10%中性福尔马林溶液固定，制作石蜡切片，常规H.E.染色，进行组织病理学检查。

1.2.5 金香颗粒对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道蠕动的影响 60只试验鼠分组及给药方式按照1.2.2。接种大肠杆菌30 min后每只小鼠灌服碳素墨水0.1 mL。 20 min后处死小鼠并剖检，测量幽门到墨水运行最远端以及幽门到回盲部的长度。

1.2.6 金香颗粒对大肠杆菌性腹泻小鼠的腹膜炎性渗出的影响 60只试验鼠分组及给药方式按照1.2.2进行。接种大肠杆菌30 min后，每只小鼠尾静脉注射0.5%依文思兰生理盐水溶液0.1 mL，然后腹腔注射0.7%乙酸0.2 mL，30 min后处死。收集生理盐水腹腔冲洗液并定容至10 mL，经10 000 r/min 离心5 min，取离心后上清液用酶标仪检测样品OD610 nm值，计算出冲洗液中依文思兰含量。

1.2.7 金香颗粒对大肠杆菌性腹泻小鼠小肠组织中MPO和SOD的影响 60只试验小鼠分组以及给药方式与1.2.2相同。接种大肠杆菌30 min后，取小鼠小肠组织，制备5%的组织匀浆。按MPO试剂盒说明书，进行小肠组织MPO活性的测定。取小肠组织匀浆上清液，测定肠道SOD值，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.2.8 数据统计与分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，试验数据表示为平均值±标准差，使用ANOVA多重比较分析中的LSD检验(t检验)分析数据显著性。

2 结果

2.1 小鼠腹泻模型建立 不同剂量组腹泻率及死亡率如表1所示，5×108CFU组死亡率为0，腹泻率为100%；上述结果显示，5×108CFU的菌落数为最佳接种剂量，该剂量既不引起小鼠死亡又能使所有小鼠发生腹泻。

表1 不同给菌量小鼠的死亡率与腹泻率

2.2 金香颗粒对小鼠腹泻的预防作用 如表2所示，与感染不给药组相比，高剂量组与药物对照组的稀便率与腹泻指数极显著降低(P<0.01)。高剂量组与药物对照组相对比，其腹泻率、稀便率、腹泻指数均比较低。上述结果表明，金香颗粒对小鼠大肠杆菌性腹泻具有很好的预防效果，且显著优于对照药物白头翁散。

表2 各组临床指标统计比较

2.3 组织病理学结果 如中插彩版图1所示，大肠杆菌引起的腹泻小鼠的小肠(中插彩版图1E)与空白对照组小鼠(中插彩版图1F)相比，内层细胞排列松散稀疏，小肠内部结构混乱并且出现膨胀，密度不均一，并出现大量空泡。小鼠肠道的上述组织病学变化显示，5×108CFU的菌落数可以引起小鼠肠道的损伤，从而引起腹泻。高剂量组(中插彩版图1A)、中剂量组(中插彩版图1B)与药物对照组(中插彩版图1D)的小肠上皮结构相似，排列密集整齐，细胞变性微小，未见组织空泡。低剂量组(中插彩版图1C)见肠绒毛上皮细胞有部分脱落，排列稀松。上述结果显示，高、中剂量组与药物对照组都可以降低大肠杆菌腹泻所引起的肠道组织的病理学变化，并且呈现明显的剂量依赖性。

2.4 金香颗粒对肠道蠕动的影响 对小鼠碳素墨水推进率进行测定，结果如表3所示，感染不给药组的碳素墨水推进率比空白对照组相比有明显升高(P<0.05)，表明大肠杆菌感染可以显著加快肠道蠕动而引起腹泻。与感染不给药组相比，高剂量组及药物对照组的碳素墨水推进率显著降低(P<0.05)。表明金香颗粒可以通过降低肠道的蠕动从而减少腹泻发生，呈现明显的剂量依赖性。

表3 小鼠肠道碳素墨水推进率

2.5 金香颗粒对炎性渗出的抑制作用 金香颗粒对小鼠腹腔依文思蓝渗出浓度的影响结果如表4所示，与感染不给药组相比，高、中、低剂量组、药物对照组的依文思蓝浓度有显著降低(P<0.01)。表明金香颗粒抑制小鼠腹腔依文思蓝渗出浓度呈现明显的剂量依赖性，可以通过抑制炎性渗出从而降低腹泻率。

表4 小鼠腹腔依文思蓝浓度

2.6 金香颗粒对腹泻模型小鼠肠道中MPO含量的影响 如表5所示，感染不给药组与空白对照组相比，小鼠肠道中MPO的含量呈现极显著升高(P<0.01)。高剂量和中剂量组肠道中MPO的含量显著低于感染不给药组(P<0.05)。随着金香颗粒的使用剂量提高，肠道中的MPO的含量越低。表明高、中剂量组可以显著降低大肠杆菌腹泻小鼠肠道组织MPO的含量水平。

表5 小鼠肠道中MPO的含量

2.7 金香颗粒对腹泻模型小鼠肠道中SOD含量的影响 由表6中可以看出，感染不给药组与空白对照组相比，小鼠肠道中SOD的含量有极显著降低(P<0.01)。与感染不给药组相比，高、中剂量组、药物对照组小鼠肠道中SOD的含量均极显著升高(P<0.01)。上述结果表明，高、中剂量组能够显著提高腹泻模型小鼠肠道SOD含量，有助于消除炎性引起的损伤。

表6 小鼠肠道中SOD的含量

3 讨论

金香颗粒主要由贯叶金丝桃、石菖蒲、蜘蛛香三味药物组成。本试验通过小鼠大肠杆菌性腹泻预防试验，肠道蠕动试验，小鼠腹腔依文思蓝渗出试验和肠道内MPO和SOD含量的测定来评价金香颗粒对大肠杆菌性腹泻的预防作用及其机制。

在小鼠腹泻预防试验中，金香颗粒高剂量组与感染不给药组相比，稀便率与腹泻指数极显著降低(P<0.01)，这说明金香颗粒对大肠杆菌性小鼠腹泻起到了明显的预防作用，这可能与药物成分的作用功效有关，对贯叶金丝桃很多临床研究发现，其提取物金丝桃素和一些黄酮类物质具有很好对抗菌消炎作用[5]，蜘蛛香提取物对大肠杆菌有抑菌作用[6]。石菖蒲提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.25 g/mL[7]。3种药物组方联合用药，可以起到抗菌消炎作用，因此对大肠杆菌性腹泻表现出预防效果。

肠道运动增强是腹泻发生发展的重要因素。在有毒有害物质的刺激作用下，肠道发生反射性蠕动加强，致使肠道内容物快速通过肠道后排，以稀便、水便的方式排出体外，发生腹泻[8]。本试验发现，高、中剂量的金香颗粒能够显著降低小鼠小肠的运动，从而减缓内容物在肠道中的推进速度，表明金香颗粒可通过抑制肠道蠕动来减缓腹泻的发生。这可能与药物成分有明显的抑菌作用相关[9]，因为金香颗粒抑制大肠杆菌繁殖，减少毒素产生，减弱由于毒素刺激而引起的运动加快，抑制肠道的运动状态对腹泻具有减缓作用[10]。这些结果也与近几年关于蜘蛛香和石菖蒲的药理作用研究相符。蜘蛛香中分离发现了大量新的环烯醚萜类物质，可对实验大鼠肠应激综合征(IBS)具有明显改善作用，可抑制IBS大鼠胃肠功能亢进[11]。石菖蒲的根茎中主要成分是挥发油，能够双向调节中枢神经系统、可以起到镇静、调节胃肠道等的作用，直接抑制家兔离体肠肌自发性和至痉剂引起的痉挛收缩[12]。

在炎症反应初期中性粒细胞最早到达感染或损伤部位，并在炎症部位聚集[13]，被激活后会释放MPO，肠道组织中MPO含量体现炎症的严重程度。大肠杆菌性腹泻肠道病理变化主要表现为卡他性炎症，炎症发展的程度与疾病的严重程度与转归密切相关。研究发现，金香颗粒高、中剂量可以明显抑制腹泻小鼠肠道中MPO的上升。说明金香颗粒通过抑制MPO的异常升高和中性粒细胞在组织中的浸润的机制预防大肠杆菌性腹泻。

本试验结果表明，金香颗粒对大肠杆菌引起的腹泻具有很好预防作用，并且可以通过调节胃肠蠕动、减炎性渗出、抗炎、抑制炎症产生的自由基等作用来预防腹泻的发生。本试验为金香颗粒预防大肠杆菌性腹泻的作用机理提供了理论基础，为后期的临床研究提供了数据支持。