紫娟茶化学成分及其抗炎抗氧化活性研究

李明超，桂浩鑫，李晓蕾，刘 莹，李宇倩，徐天瑞，郝 倩*

1昆明理工大学生命科学与技术学院 云南省高校靶点药物筛选与利用重点实验室，昆明 650500；2昆明理工大学分析测试中心，昆明 650093

“紫娟”为山茶科(Theaeeae)山茶属(Camellia)茶组植物(Camelliasinensis(L.) O．Kuntze),是云南大叶茶变种，因其芽尖、叶、茎、花萼、花梗呈紫色，其茶汤呈淡紫色而得名[1]。紫娟有云南大叶群体国家级茶树良种单株培育而成[2]，与常规大叶绿茶相比，其所含花青素、黄酮类、咖啡碱、锌的含量较高[3]。研究发现紫娟茶具有抗氧化[4]、抗炎[5]、降压[6]、降脂[7]、抗增殖[8]及抑菌[9]等功效，其化学成分主要含有花青素类、黄酮及其苷类和儿茶素类[2,3]。本文对紫娟甲醇提取物进行分离纯化，旨在丰富该植物的化学成分研究。此外，对分离得到的化合物进行了抗炎和抗氧化活性测定，为紫娟茶的进一步开发利用提供理论参考。

1 仪器与材料

Avance III 600 MHz超导核磁共振仪(瑞士Bruker BioSpin公司)，ODS(日本YMC维美希公司)，Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司)，Diaion HP 20SS(日本三菱公司)，Toyopearl HW40F(日本东曹公司)，高效液相色谱仪(日本岛津制作所)，80～100目和200～300目柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)，硅胶GF254薄层预制板(青岛海洋化工厂)，超纯水仪(南京权坤生物科技有限公司)，超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，三用紫外分析仪(上海力辰仪器科技有限公司)，氘代试剂(美国剑桥CIL(同位素标准品)公司)，色谱纯甲醇和乙腈(美国BCR公司)，其他试剂为分析纯(西陇化工公司(四川))，一氧化氮测定试剂盒(碧云天生物技术公司)。

紫娟茶2017年购买于云南省西双版纳傣族自治州勐海县，样品由昆明理工大学生命科学与技术学院郝倩博士鉴定，样品标本(ZJ-1701)存于昆明理工大学基础化学实验中心403实验室。

2 实验方法

2.1 提取和分离

紫娟茶1.5 kg，用3倍量的70%的甲醇水(含1%的TFA)超声提取4次，过滤，减压浓缩后经乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相(AcOEt Fr.)182.4 g，水相(Aq Fr.)256.5 g。取乙酸乙酯部分(14.2 g)，经过Diaion HP 20SS柱色谱甲醇水(0%→100%)梯度洗脱，得到6个组分Fr.1～Fr.6。Fr.2(0.21 g)采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)洗脱，得到化合物1(10.7 mg)(图1)。Fr.4(1.20 g)经Diaion HP 20SS柱色谱甲醇-水(0%→100%)梯度洗脱，得到Fr.4-1～Fr.4-9。其中Fr.4-3(651.8 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)洗脱，分离得到化合物2(3.1 mg)和化合物3(40.4 mg)，Fr.4-5(66.4 mg)经ODS柱色谱甲醇-水(20%→100%)得到化合物4(2.8 mg)和化合物5(2.1 mg)；Fr.4-9经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇)纯化得到化合物6(31.5 mg)。Fr.5(3.39 g)Toyopearl HW40F柱色谱甲醇-水(20%→100%)梯度洗脱，合并相同流分得到Fr.5-1～Fr.5-3，Fr.5-1经 ODS柱色谱甲醇-水(20%→100%)洗脱得化合物7(9.7 mg)，Fr.5-2分别经Sephadex LH-20凝胶柱色谱乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)和ODS柱色谱甲醇-水(20%→100%)进行洗脱，分离得到化合物化合物8(182.9 mg)。取水相部分(46.5 g)，经Diaion HP 20SS柱色谱甲醇-水(0%→100%)梯度洗脱，得到9个组分Fr.w1～Fr.w9。Fr.w2(4.72 g)依次经Toyopearl HW40F柱色谱甲醇-水(20%→100%)，ODS柱色谱甲醇-水(20%→100%)梯度洗脱得到化合物9(12.1 mg)。Fr.w5(1.87 g)经Toyopearl HW40F柱色谱甲醇-水(20%→100%)，ODS柱色谱甲醇-水(20%→100%)梯度洗脱得到化合物10(10.8 mg)和化合物11(2.2 mg)。Fr.w7(2.31 g)经Diaion HP 20SS柱色谱甲醇-水(20%→100%)得到化合物12(12.0 mg)。Fr.w9(10.79 g)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱尿素-丙酮洗脱得到聚合物(Polymer Fr.)3.01 g。

2.2 活性测定

2.2.1 抗炎活性测定

将小鼠巨噬细胞RAW264.7按照6×104/mL的浓度铺于96孔板，37 °C、5%CO2的培养箱中常规培养于DMEM 培养基中，18 h后加入浓度0.8 μg/mL脂多糖(LPS)，反应24 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗去LPS，清洗两遍，之后加药处理。药物配置方法如下：紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物按照5或50 μg/L的浓度溶解于无血清培养基；化合物1～12按照5和50 μmol/L的浓度溶解于无血清培养基。处理24 h后，使用碧云天生物技术公司生产的一氧化氮检测试剂盒(货号：062119191005)，按步骤操作，使用酶标仪在540 nm下进行测定并计算出样品中的NO浓度。

2.2.2 抗氧化活性测定

将人肺泡上皮细胞A549按照6×104/mL的浓度铺于96孔板，37 °C、5% CO2的培养箱中常规培养于含有10%的血清的DMEM培养基中，18 h后加入浓度0.8 μg/mL过氧化氢(H2O2)，反应24小时后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗去H2O2，清洗两遍，之后加药处理。药物配置方法如下：紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物按照5或50 μg/L的浓度溶解于无血清培养基；化合物1～12按照5 μmol/L和50 μmol/L的浓度溶解于无血清培养基。

图1 化合物1～12的结构Fig.1 The structures of compounds 1-12

加药处理24 h后，1 000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀。用活性氧特异性探针DCFH-DA(无血清培养基1∶1 000稀释)重悬细胞，每5 min混匀1次，共染色20 min，用荧光酶标仪检测荧光强度(激发光波长488 nm，发射光波长525 nm)。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1黄色粉末；分子式为：C15H10O6；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：8.08(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2'，H-6')，6.90(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3'，H-5')，6.38(1H，s， H-6)，6.18～6.15(1H，m，H-8)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物1为山柰酚。

化合物2灰白色粉末；分子式为C15H14O6；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.87(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，6.70(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-5′)，6.65(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6′)，5.84(1H，d，J= 2.3 Hz，H-8)，5.81(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6)，4.09～4.06(1H，m，H-2)，3.25(1H，s，H-3)，2.78～2.74(1H，m，H-4a)，2.63(1H，dd，J= 16.7，2.8 Hz，H-4b)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物2为(+)-表儿茶素。

化合物3白色无定形粉末；分子式为C22H18O10；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.85(2H，s，H-2′′，6′′)，6.84(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.71(1H，dd，J= 8.3，1.9 Hz， H-5′)，6.60(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6′)，5.87(2H，q，J= 2.3 Hz，H-6，8)，5.42(1H， m，J= 4.2，2.3 Hz，H-3)，4.91(1H，s，H-2)，2.89(1H，dd，J= 17.3，4.6 Hz，H-4a)，2.75(1H，dd，J= 17.4，2.1 Hz，H-4b)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物3为(-)表儿茶素没食子酸酯。

化合物4黄色粉末；分子式为C15H10O8；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.34(2H，s，H-2′，6′)，6.37(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)；13C NMR(150MHz，CD3OD)δ：175.8(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，156.7(C-9)，146.5(C-2)，145.3(C-3′，5′)，135.9(C-4′)，135.5(C-3)，107.0(C-2′，6′)，103.0(C-10)，121.6(C-1′)，97.7(C-5)，92.9(C-8)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物4为杨梅素。

在DH6101伏安特性仪实验平台上，伏安法测二极管2AP10和1N4007伏安特性采用电流表内接法和电流表外接法，电路示意如图1所示。电源电压在0～10 V内调节。通过对这两种方法电路图分析，发现这两种实验方法都会存在误差，其主要来源于电表内阻接入电路而引起。在电流表外接实验中，电压表和电流的读数分别是U和I时，由于电压表内阻会进行分流，这样实际通过二极管的电流I'是小于I，它们之间满足下面的关系式[6]：

化合物5白色粉末；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.97(1H，d，J= 1.9 Hz， H-2″)，6.92(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6″)，6.86(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.71(1H，dd，J= 8.3，1.9 Hz， H-6′)，6.61(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′)，5.92～5.79(2H，m，H-6，8)，5.41(1H，dt，J= 4.3，2.6 Hz，H-2)，4.97(1H，s，H-3)，3.72(3H，s，-OCH3)， 2.91(1H，dd，J= 17.3，4.6 Hz，H-4a)，2.79(1H，dd，J= 17.4，2.5 Hz，H-4b)，13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：166.1(C=O)，155.8(C-9)，156.5(C-5，7)，147.6(C-3″，5″)，144.6(C-3，4′)，139.1(C-4″)，130.1(C-1′)，120.0(C-1″)，117.7(C-6′)，114.5(C-5′)，113.6(C-2′)，110.4(C-2″，6″)，97.89(C-10)，95.0(C-6)，94.3(C-8)，77.1(C-2)，68.9(C-3)，25.2(C-4)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物5为表没食子儿茶素-3-O-(3″-O-甲基)没食子酸酯。

化合物6黄色粉末；分子式为C15H10O7；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.73(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.63(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：175.9(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，156.8(C-2)，147.3(C-9)，146.5(C-3′)，144.8(C-4′)，135.8(C-3)，122.7(C-3)，120.2(C-6′)，114.8(C-2′)，114.5(C-5′)，103.1(C-10)，97.8(C-6)，92.9(C-8)。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物6为槲皮素。

化合物7无色针状结晶；分子式为 C7H6O5；1H NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：6.87(2H，s，H-2，6)。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物7为没食子酸。

化合物8白色粉末；分子式为C22H18O11；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.96(2H，s，H-2″，6″)，6.52(2H，s，H-2′，6′)，5.98(1H，s，H-6)，5.56～5.49(1H，m，H-3)，2.99(1H，dd，J= 17.2，4.6 Hz，H-4a)，2.86(1H，dd，J= 17.4，2.2 Hz，H-4b)。以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物8为表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯。

化合物9白色粉末；分子式为C14H16O10；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.00(2H，s，H-2″，6″)，5.28(1H，q，J= 6.4 Hz，H-3)，4.16(1H，dt，J= 7.2，3.5 Hz， H-5)，2.28(2H，dd，J= 12.7，3.6 Hz，H-2)，2.15(1H，dd，J= 13.4，3.6 Hz，H-6a)， 1.97(1H，dd，J= 13.0，8.5 Hz，H-6b)。以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物9为3-O-没食子酰基奎宁。

化合物10浅棕色粉末；分子式为C27H22O18；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，s，H-2″，6″)，6.69(1H，s，HHDP-H)，6.55(1H，s，HHDP-H)，5.67(1H，d，J= 8.1 Hz，H-1)，5.23(1H，dd，J= 13.3，6.4 Hz，H-6)，4.88～4.82(1H，s，H-4)，4.08～4.02(1H，m，H-5)，3.82(1H，d，J= 12.7 Hz，H-3)，3.75～3.69(1H，m，H-6)，3.62(1H，d，J= 8.2 Hz，H-2)。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定化合物10为小木麻黄素。

化合物11淡黄色粉末；分子式为C27H24O18；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，s，H-2′′′，6′′′)，7.09(2H，s，H-2′′，6′′)，7.06(2H，s，H-2′，6′)，5.78(1H，d，J= 8.2 Hz，H-4)，5.22(1H，t，J= 9.7 Hz，H-4)，4.43(1H，dd，J= 12.4，2.1 Hz，H-6)，4.21(1H，dd，J= 12.4，4.8 Hz，H-1)，4.05(1H，ddd，J= 10.0，4.8，2.2 Hz，H-3)，3.83(1H，t，J= 9.3 Hz，H-5)；13CNMR(150 MHz，CD3OD)δ：166.6(C-7′)，166.0(C-7′′′)，165.5(C-7′)，145.1(C-5′)，145.1(C-5′′′)，145.0(C-5′′)，139.0(C-4′′)，138.6(C-4′)，138.4(C-4′′′)，119.7(C-1′′)，119.5(C-1′)，119.1(C-1′′′)，109.1(C-2′，6′)，108.9(C-2′′， 6′′)，108.8(C-2′′′，6′′′)，94.4(C-1)，74.6(C-5)，73.0(C-3)，72.8(C-2)，70.4(C-4)，62.1(C-6)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物11为1，4，6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖。

化合物12白色粉末；分子式为C8H10N4O2；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.76(1H，s)，3.90(3H，s)。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物12为咖啡因。

3.2 活性测定结果

3.2.1 抗炎活性测定结果

本实验运用脂多糖(LPS) 诱导的小鼠巨噬细胞生成的NO 细胞模型对紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物进行了抗炎活性测定，以LPS为阳性对照，测试浓度为5和50 μg/L；同时，对化合物1～12进行了抗炎活性测定，以LPS为阳性对照，测试浓度为5和50 μmol/L，通过测定粗体物或化合物抑制NO的生成来评价其抗炎活性。

结果(见图2)显示，5或50 μg/L浓度下粗提物、乙酸乙酯相，50 μg/L的聚合物均有一定的抗炎活性。在5和50 μmol/L的浓度下，化合物1、3、4、6、8～11均对NO抑制率显著，表明其具有显著的抗炎活性。

图2 紫娟茶提取物和化合物1～12抗炎活性测定Fig.2 Anti-inflammatory activity of Zijuan tea extract and compounds 1-12

3.2.2 抗氧化活性测定结果

结果见图3，5 μg/L的粗提物、乙酸乙酯相，50 μg/L乙酸乙酯相、聚合物均具有显著的抗ROS活性，表明其具有明显的抗氧化活性。化合物1～3、11～12抗ROS活性均显著，表现出明显的抗氧化活性。其中化合物11的抗氧化活性最明显。

图3 紫娟茶提取物和化合物1～12抗氧化活性测定Fig.3 Determination of antioxidative activity of Zijuan tea extract and compounds 1-12

4 结论

目前，对紫娟茶中的功能性成分研究较少，因此本文对紫娟茶的化学成分进行了系统研究。从中共分离鉴定了12个化合物以及大量聚合物，其中3个黄酮类化合物(1、4、6)、4个儿茶素类化合物(2、3、5、8)，2个单宁类化合物(10和11)，1个奎宁类化合物(9)，1个没食子酸(7)以及1个咖啡因(12)。通过抗炎、抗氧化活性实验发现化合物11表现出良好的抗氧化活性，化合物1、3、4、6、8～11均具有显著的抗炎活性。此外，从紫娟茶水相分离得到的聚合物中含有抗炎、抗氧化活性成分，今后可深入研究其组成及药理活性。本文为紫娟茶的综合开发和利用提供了一定理论基础和依据。