一例猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

郭 旋 李华泳 张 宁 曾 香 刘德清 马青兰 王艳午 蒋振南 冯建远

（广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西南宁 530042）

猪链球菌是引起猪链球菌病的最主要病原，主要引起猪脑膜炎、关节炎、心肌炎、肺实质性病变和败血症等症状。与疾病最为相关的是猪链球菌2型，1991年我国广东省首次报告该病的发生[1]。猪链球菌是猪场常在菌，发病率较高，当饲养管理不善时更易发病，容易与其他疾病发生混合感染或作为蓝耳病、圆环病毒病等免疫抑制性疾病的继发病，给猪只的健康生长带来威胁[2,3]。因此,开展细菌性疾病的快速分离鉴定，通过药敏试验筛选敏感药物，减少药物滥用，精准用药并通过生物安全防控和良好的生产管理可有效降低细菌性疾病发生，降低死淘率，并达到“减抗”的目标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2019年11月，广西南宁市西乡塘区某猪场20kg左右的保育猪，零星出现体温升高至40.5～41.5℃，突然倒地，四肢做游泳状划动。病弱猪隔离栏有7头出现后肢关节肿大、脚痛症状。对其中2头倒地猪进行解剖，无菌采集病猪脑、肺脏、淋巴结。将2头后肢关节肿大的猪，用一次性无菌注射器无菌采集肿大处的关节液。样品采集后置于含冰块的泡沫箱中2 h内，送往实验室进行检测。

1.1.2 试剂

2×TapMix购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；药敏纸片购自温州市康泰生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒、哥伦比亚血平板、TSB培养基和MH琼脂培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列参考GB/T 19915.4-2000，适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测。见表1。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌采集脑和关节液接种于哥伦比亚血平板，培养24h。用接种环挑取具有溶血环的疑似猪链球菌小菌落，接种到 1 个新的哥伦比亚血平板中培养 24 h，同时接种到含 5%血清的 TSB 培养基进行增菌培养 24 h。

表1 链球菌PCR扩增引物

1.2.2 触酶反应

用灭菌接种环将纯培养的疑似猪链球菌小菌落挑入1 mL 灭菌生理盐水中，振荡，制成悬液，然后加入1 mL 3%过氧化氢溶液，同时用金黄色葡萄球菌的盐水菌悬液做阳性对照，观察是否出现气泡。

1.2.3 细菌的染色镜检

挑取疑似猪链球菌的纯培养菌落涂布于载玻片中，采用革兰氏染色法进行染色后置于显微镜高倍镜下镜检，观察细菌形态。

1.2.4 PCR 鉴定

参考 GB/T 19915.4-2000 进行 PCR 检测。取 200 μL TSB 中的增菌培养液，12 000 r/min 离心 5 min，弃去培养基，用无菌双蒸水洗涤沉淀 2 次，并用 100 μL超纯水重悬细胞。采用煮沸裂解法制备细菌 DNA 模板，即将重悬菌液煮沸 10 min，瞬时置于冰浴中冷却 5 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液作为 DNA 模板。PCR 反应体系为：2×TapMix 12.5 μL、6 条引物各 0.5 μL，cDNA 样品 3 μL，补 ddH2O 至 25 μL。扩增条件为：94℃预变性 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃延伸 40 s，30 个循环；72℃延伸 4 min，4℃保存。将PCR 扩增产物进行凝胶电泳。

1.2.5 K-B 药敏试验

用灭菌棉签刮取纯培养的菌落溶解于灭菌生理盐水中，制备成 0.5 麦氏单位标准的菌悬液。用无菌棉拭子蘸取菌悬液均匀涂布于 MH 琼脂平板上，放置 3～5 min干燥后贴上药敏纸片，于 37℃培养 24 h 后，测量抑菌环直径[4]。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

在其中1头猪的脑中分离到1株疑似菌株。在哥伦比亚血平板中的疑似菌落呈细小、圆形凸起的灰白色菌落，菌落周边呈β溶血。

2.2 触酶反应结果

金黄色葡萄球菌的盐水菌悬液与3%过氧化氢溶液反应出现大量气泡，阳性对照成立。纯培养的疑似猪链球菌盐水菌悬液与3%过氧化氢溶液反应无气泡出现，触媒反应阴性。

2.3 细菌的染色镜检结果

在显微镜油镜下观察，哥伦比亚血平板上纯培养的菌落被革兰氏染液染成紫色，为球状，呈单个、成对或短链排列，见图1。在含5%血清的TSB培养物被革兰氏染液染成紫红色，为球状，多数呈长链状排列，见图2。

2.4 PCR鉴定结果

对扩增产物进行凝胶电泳，结果显示被测样品在250 bp～500 bp之间的387 bp处出现目的条带，可判定为猪链球菌2型。见图3所示。

2.5 K-B药敏试验结果

选择养殖场常用的14种药物的药敏纸片做药敏试验，结果如表2。分离菌对多西环素、氧氟沙星、万古霉素、恩诺沙星高度敏感；对青霉素、头孢曲松、环丙沙星、诺氟沙星和氟苯尼考敏感；对氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、杆菌肽和庆大霉素耐药。

3 讨论

对猪场细菌性疾病进行快速鉴别诊断，并开展药敏试验筛选敏感药物，是快速治疗细菌性疾病，减少发病率和病死率的重要方法。本试验结合猪场背景、发病猪的临床症状和病理解剖变化，初步怀疑为猪链球菌感染。通过从病猪脑部分离培养细菌，采用染色液镜检、触媒试验和PCR鉴别诊断，确定为猪链球菌2型感染。然后开展药敏试验，筛选敏感药物。

表2 分离菌株药敏试验结果

由于国家“减抗”“禁抗”措施的推进，链球菌等细菌性疾病的防控不能再继续依靠使用大量抗生素进行普防或治疗，而应该逐渐通过加强生物安全综合防控、疫苗免疫等措施[5]。同时，自2018年8月我国首次发生非洲猪瘟疫情以来，养猪业遭受了巨大损失，生物安全防控被证实为目前最有效的非洲猪瘟防控方法，短时间内推动了我国养猪场生物安全体系的跨越式提升，也将有利于对其他疫病的防控。本试验分离到的猪链球菌来源的猪场，有使用阿莫西林给保育猪饮水保健，以防治转群后应激产生细菌性疾病的习惯，可能是导致本次药敏试验中阿莫西林耐药的原因之一。因此，结合药敏试验结果筛选敏感药物，减少药物保健和阿莫西林使用频次，精准用药并逐渐减少抗生素用量，通过生物安全防控和良好的生产管理来达到减少疾病发生和达到“减抗”的目标。

11月份南方天气开始转凉，昼夜温差大，部分猪场为了减少温差会在夜间下卷帘或是减少通风来给猪舍保温，从而也导致了猪舍空气混浊，氨气刺激等造成猪只抵抗力下降，容易诱发细菌性疾病。本研究的样品来源猪场保育猪出现咳嗽，部分猪只出现脚痛和突然倒地伴随发烧等症状，前期对病猪肌注头孢噻呋钠和安痛定，没能有效治愈病猪。因而对病猪进行解剖并采样送实验室检测。在1头发生神经症状的保育猪脑中分离培养到1株链球菌，经PCR鉴定为猪链球菌2型。参考药敏试验结果，对神经倒地猪只注射磺胺嘧啶钠和地塞米松，喘气并发烧的猪只注射氟苯尼考和VC，隔离栏病弱猪在饮水中添加多西环素。7天后病猪康复，并没有新增病例。同时对其他未发病的猪舍通过调节通风与保温相平衡来保持栏舍环境适宜、干燥清洁，及时隔离好打斗猪只，减少猪只外伤和应激，减少猪链球菌病的发生。

4 结论

本研究对发生倒地、有神经症状的保育猪进行解剖，通过细菌分离培养、染色液镜检、触媒试验和PCR鉴别诊断，分离到1株2型猪链球菌。药敏试验结果筛选了敏感药物，结合猪场情况进行敏感药物治疗和强化生产管理、生物安全防控措施，有效治愈病猪并降低了发病率，可为其他养猪场秋季防治细菌性疾病提供参考。