姜黄素与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合用药抗乳腺癌活性研究

廖友生 康小英

【摘 要】本文通过体外细胞和裸鼠皮下移植瘤模型来探讨姜黄素与组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合用药对乳腺癌的治疗效果。实验结果表明，姜黄素与SAHA联合用药在体外细胞和体内肿瘤模型中均展现出了良好的抗乳腺癌活性，并强于姜黄素或SAHA单独用药;此外，姜黄素与SAHA联合用较SAHA单独用药具有更高的安全性。这些结果为乳腺癌的联合用药提供了一定的参考，值得进一步研究。

【关键词】： 姜黄素; 组蛋白去乙酰化酶抑制剂;联合用药; 抗乳腺癌活性

【中图分类号】R539【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2020）08--01

乳腺癌已经成为全球女性的头号杀手，其发病率正在逐年升高，并年轻化。目前在临床上主要采用激素替代治疗法，但是长期用药容易出现耐药性[1];此外，有约25%左右的乳腺癌患者是三阴性乳腺癌，由于缺乏治疗靶点，传统的激素替代治疗法对其无效，并对化疗不敏感，患者生存期较低[2]。因此，发展新型的治疗方法对乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌，具有重要的意义。

近年来研究发现，癌症包括乳腺癌是一个多基因疾病，仅仅抑制单一靶点通常难以取得预期的治疗效果，并很容易出现耐药性。相应地，从多个角度攻击疾病可克服许多单靶点药物的缺点，由此产生多靶点治疗可以同时调节肿瘤网络系统的多个途径，能够提供治疗效果并不易产生耐药性，现已在很低重大疾病治疗中开始应用[3]。因此，在本研究中我们探讨了在单独使用时对乳腺癌均具有治疗效果的姜黄素与组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA在联合用药后对乳腺癌的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料与细胞株

姜黄素和伏立诺他 （SAHA）均购置北京伊诺凯科技有限公司 （质量分数≥98%）;无酚红的DMEM培养基和胎牛血清均购自Hyclone公司;MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO细胞株均购自中科院上海细胞典藏中心。Balb/c裸鼠，4-5 周龄，体重 16-22g，购置北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京） 2016-0011）。

1.2 细胞培养

将MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A三种细胞接种于75 mL的培养瓶中，加入含有10%胎牛血清的无酚红的DMEM培养液，在37 °C、5% CO2 培养箱中孵育进行传代。

1.3 动物模型构建

取对数生长期的MDA-MB-231细胞用胰酶消化后，离心并收集细胞，然后用Matrigel胶将MDA-MB-231细胞进行混悬。于裸鼠右侧肩部皮下种植0.2 mL的MDA-MB-231细胞混悬液 （4×106 ～ 5 ×10 6细胞）。

1.4 体外抗肿瘤活性实验

采用MTT法对姜黄素、SAHA以及姜黄素和SAHA联合用药组进行体外抗乳腺癌活性测试。其中乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株为测试细胞株，正常乳腺上皮细胞MCF-10A和正常非洲绿猴肾细胞VERO为对照细胞株。将测试药物用DMSO溶解后，再用无酚红的DMEM培养基稀释成不同的浓度。取对数生长期的MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO细胞铺至96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL （4～8）×104个/mL的细胞混悬液。置于37 oC、5% CO2培养箱中孵育12小时后待细胞完全贴壁弃去原培养液，每孔加入100 ?L含有不同浓度待测试药物的培养液，继续孵育3天，加入30 μL 5 mg/mL 的MTT，继续孵育4小时后，弃去培养液，每孔每孔加入100 μL 二甲亚砜 （DMSO）溶解。用酶标仪在490 nm波长处测定每孔的吸光度（OD）值，并计算出药物对肿瘤细胞的抑制率。

1.5 体内抗肿瘤活性实验

向裸鼠接种MCF-7细胞后，待荷瘤体积长至约50 mm3大小时，随机将裸鼠分成空白对照组、姜黄素组、SAHA组和姜黄素与SAHA的联合用药组，每组 4只，均进行灌胃给药，实驗组每组给予 25 mg/kg的剂量，对照组给予等体积的生理盐水对照，每2天给药一次，在给药18天后将所有裸鼠的肿瘤取下，称量肿瘤的重量，计算出肿瘤的抑制率。肿瘤抑制率 （%） = （1-T/C） × 100，T和C分别表示治疗结束后实验组和对照组肿瘤的重量。

2 结果

2.1 体外抗肿瘤活性

体外抗乳腺癌的结果如表1所示，姜黄素和SAHA对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231均有明显地抑制活性，其IC50均低于20 μM。当姜黄素和SAHA联合用药时，其抗MCF-7和MDA-MB-231的活性较单独用姜黄素或SAHA时均明显地提高。这些结果说明姜黄素和SAHA联合用药具有更强地抗肿瘤效果。更重要的是，尽管SAHA对正常的乳腺上皮细胞MCF-10A没有毒性，但是其对正常的VERO细胞却展现出了一定的毒性 （IC50 = 4.1 μM），而采用联合用药后其毒性明显地降低 （IC50 = 31.8 μM）。这个结果表明联合用药组较SAHA单独用药具有更高的安全性。

2.2 体内抗肿瘤活性

在体外研究中，姜黄素与SAHA联合用药对MDA-MB-231细胞展现出优秀的抗肿瘤活性。因此，我们构建了MDA-MB-231动物模型来研究联合用药在动物体内抗肿瘤活性，结果如表2所示。姜黄素和SAHA对肿瘤的抑制率分别为21.1%和49.1%，而联合用药组的抑制率为53.1%。这些结果说明姜黄素与SAHA联合用药的体内抗肿瘤效果也要强于单独用药。

3 讨论

姜黄素是从中药姜黄的根茎中提取到的一类酚类色素，具有明显地抗肿瘤活性。姜黄素的抗肿瘤活性具有多效性和途径多样性，对同一肿瘤能同时发挥多种效能，一类多靶点的药物[4]。例如，在治疗乳腺癌中能同时通过特异性诱导乳腺癌细胞凋亡、抑制乳腺癌细胞代谢、影响乳腺干细胞等多途径发挥治疗效果[5]。此外，因其毒副作用小、安全性高等特点常和其他抗肿瘤药物如卡铂进行联合用药来治疗乳腺癌[6]。

组蛋白去乙酰化酶 （histone deacetylase， HDAC）是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰与基因表达调控发挥着重要的作用，与肿瘤的发生、发展密切相关，在肿瘤细胞中包括乳腺癌细胞HDAC呈现出过表达状态[7]。HDAC抑制剂能够HDAC的表达，同时抑制肿瘤细胞的分化，促进肿瘤细胞凋亡。目前已有多种HDAC抑制剂被开发用来治疗不同的肿瘤[8]。但是，HDAC抑制剂通常具有一定的毒副作用[9]，这限制了其在临床上的应用。

近年来研究发现，天然产物不仅具有抗肿瘤活性，而且低毒，将其与其他抗肿瘤药物联用将具有更好的疗效和更高的安全性[10]。因此，在本研究中，我们将天然产物姜黄素与HDAC抑制剂SAHA联用来治疗乳腺癌。我们的结果表明，姜黄素与SAHA联用后不仅较单独使用姜黄素或SAHA提高了治疗乳腺癌的效果，还较SAHA有更高的安全性。这为今后乳腺癌的联合用药治疗提供了一定的参考意义。

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