响应面优化银杏叶中总黄酮的超声提取工艺研究*

于德涵，黎 莉，苏 适，王广慧

(绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

银杏(GinkgobilobaL.)又名白果，为银杏科银杏属落叶乔木[1]，叶子是传统的中草药，为我国特产植物。银杏集药用、食用、材用价值于一体，银杏叶具有200多种药用成分，从银杏叶中分离得到的黄酮已多达40多种，黄酮类化合物发挥了重要的药理作用，药理实验和临床研究证明银杏叶黄酮具有促进人体血液循环、抑制血小板活化因子、抗氧化、防止衰老过敏、调节内分泌和脂质代谢、抗肿瘤、预防老年痴呆症[2-7]等作用。目前银杏叶中黄酮药理活性广泛且，在药品、化妆品、保健品、生物农药等方面有诸多应用，银杏叶中黄酮主要存在于细胞壁内，但是传统方法提取效率低且耗时较长[8-9]，制约了银杏叶黄酮的应用。本文采用超声提取方法提取银杏叶中黄酮，可有效破坏银杏叶细胞壁，并用响应面法优化实验条件，对银杏叶黄酮的继续开发和利用提供了理论支持。

1 实 验

1.1 材料与试剂

银杏叶(饮片级)，胜亳生物科技有限公司；芦丁标准品(纯度≥98%)，北京谱析科技有限公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠(试剂均为分析纯)，国药试剂有限公司；去离子纯水，自制。

1.2 仪器设备

PS-20AD超声波清洗器，深圳市良谊实验室仪器有限公司；SHZ-DIII循环水式多用真空泵，上海科升仪器有限公司；101-0A鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；V-5100B紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线

精确称取0.005 g芦丁标准品，置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得到质量浓度为50 μg/mL的芦丁标准品溶液。再精密量取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，置于6个10 mL的容量瓶中，先后加入30%乙醇5 mL 5%，NaNO20.3 mL，静置10 min，再加10%的Al(NO3)30.3 mL，静置6 min，加2 mL 4%NaOH，最后用30%乙醇定容至刻度，摇匀静置10 min。分别在510 nm处测量吸光度，以芦丁浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.023X+0.069，R2=0.9992。

1.3.2 银杏叶黄酮提取率的计算

将银杏叶用蒸馏水洗净，烘干，粉碎，过60目筛，得银杏叶粉末，放入避光处保存。称取一定质量的银杏叶粉，在55 ℃下，超声功率400 W，按料液比1:30(g/mL)，一定浓度的乙醇溶液为提取剂，提取时间，提取温度超声提取，过滤得银杏叶黄酮提取液。

按下式计算银杏叶总黄酮提取率。

1.4 银杏叶中黄酮提取工艺优化

准确称取银杏叶粉末3.0 g，采用超声辅助法提取银杏叶中黄酮，固定料液比1:30(g/mL)、超声功率400 W，分别考察乙醇浓度(40%，50%，60%，70%，80%)、超声时间(20、30、40、50、60 min)、提取温度(40、50、60、70、80 ℃)三个因素对银杏叶中黄酮提取率的影响。

1.5 响应面实验设计

根据单因素实验，选取乙醇浓度(A)、超声时间(B)、提取温度(C)，以银杏叶黄酮提取率为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，优化银杏叶黄酮提取工艺，以黄酮的提取率为响应值，建立响应回归模型，因素水平见表1。

表1 响应面实验设计

2 结果与讨论

2.1 单因素分析

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响

图1 乙醇浓度对提取率的影响

由图1可知，乙醇浓度在40%～80%之间时，银杏叶黄酮的提取率先增大而后下降，当乙醇浓度为70%时，提取率达到最高；随后开始下降。原因可能是银杏叶黄酮在60%～70%乙醇中已经大部分溶出，如果乙醇体积分数过高，过量乙醇会将银杏叶中的其他杂质成分溶出，导致了黄酮得率下降[10]。因此，乙醇浓度选择70%。

2.1.2 提取时间对提取率的影响

图2 提取时间对提取率的影响

由图2可知，随提取时间在20～60 min之间时，银杏叶黄酮提取率逐渐增加，当提取时间为40 min时，黄酮的提取率最高；随后提取率开始下降。原因可能是时间过长超声波的空化效应和热效应，破坏了银杏叶黄酮结构的稳定性[11]，导致其提取率下降。因此，提取时间选择40 min。

2.1.3 提取温度对提取率的影响

图3 提取温度对提取率的影响

由图3可知，提取温度在40～80 ℃时，银杏叶中黄酮的提取率先增大后下降，当温度达到60 ℃时，提取率最高。原因可能是温度升高，分子运动加速，细胞破裂加快有利于黄酮的溶出，但是继续升高温度，过高温度会破坏黄酮的结构[12]，提取率下降。因此，选择提取温度60 ℃。

2.1.4 液料比对提取率的影响

图4 液料比对提取率的影响

由图4可知，料液比在1:20 mL/g时，银杏叶中黄酮提取率达到最大值，但料液比继续增大，黄酮提取率呈下降趋势。原因可能是当液料比过小时，体系内少量溶剂无法将银杏叶粉末完全润湿，黄酮化合物溶出不完全；随着液料比的增加，过量的乙醇溶剂会造成后处理中黄酮含量的损失[13]，从而降低了银杏叶黄酮的提取量。因此，银液料比选择 1:20 mL/g。

2.2 响应面结果讨论

2.2.1 响应面设计及结果

响应面实验设计方案及结果见表2。

表2 响应面实验设计方案

2.2.2 回归方程和方差分析

采用Design-Expert8.0.6软件对响应值和各因素进行回归拟合，以银杏叶黄酮提取率(Y)为响应值，得到各因子的二次回归拟合方程为：

Y=+5.00+0.22A-0.21B-0.087C-2.000E-003AB+0.065AC-9.750E-003BC-0.24A2-0.12B2+0.12C2，方差分析结果见表3。

表3 方差分析表

注：P>0.05为不显著；P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

由表3可知，根据回归方差分析显著性检验，P<0.0001，说明二次多项式模型达到极显著水平；失拟值P=0.5418>0.05，没有显著差异，表明该二次曲面能很好的拟合实验数据；确定系数R2=0.9865，说明模型方程与实验拟合程度好，实验误差小。回归模型一次项A和B极显著(P<0.01)，C显著(P<0.05)；交互项AC为模型显著因素(P<0.05)；二次项A2、B2和C2为模型极显著因素(P<0.01)。方差分析中，各因素对银杏叶黄酮得率影响的顺序为：乙醇浓度>超声时间>提取温度。综上所述，该模型可用于分析和预测银杏叶黄酮的提取率，并确定最佳提取工艺条件。

2.2.3 响应面分析

采用Box-Behnken 软件对乙醇浓度、提取时间和提取温度之间两两交互作用的关系进行分析，结果如图5所示。

图5 各因素交互作用的响应面图

使用Design-Expert 8.0.6 Trial软件分析，将三因素两两进行分析比较，做出响应面曲线图，结果见图5。响应曲面图能直观地反映各因素之间的作用对响应值的影响。由图5可知，超声时间，提取温度相对于乙醇浓度曲线陡峭，说明提取时间和提取温度对银杏叶中黄酮的提取影响较显著。

2.2.4 验证实验

通过上述响应面实验分析，得到最佳的提取工艺为：乙醇浓度63.13%，超声时间31.49 min，提取温度50 ℃，理论预计值5.316%。考虑到实际操作中的局限性，最终选择醇浓度63%，超声时间32 min，提取温度50 ℃，进行3次重复验证实验，提取率平均值为5.328%，与模型的预测值基本吻合，说明预测模型与实际情况拟合较好，具有一定的实用价值。

3 结 论

通过响应面法优化超声辅助提取银杏叶中黄酮，得到最佳工艺条件为：乙醇浓度63%、提取温度50 ℃、提取时间32 min，取率可达5.328%，回归模型拟合度较高。与传统提取工艺相比，提取效果好，优选了银杏叶黄酮的提取条件，是一种高效提取银杏叶黄酮的方法，可用于保健品、医药等领域，为今后相关的研究提供了参考。