原发性肝癌患者循环肿瘤细胞检测及其与术后复发转移的关系

刘 霞 方喜生 翁成荫 伍 勇 毛海波 李宝秀 王丽娜 刘国龙

广州市第一人民医院肿瘤内科(广州 510180)

原发性肝癌(Primary liver cancer)是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞中的恶性肿瘤，是一种临床上常见的难治性恶性肿瘤[1]。肝癌是全球第六大最常见的癌症，也是全球第四大癌症死亡原因，每年新发病人约有841 000例，其中有782 000人死亡。在我国慢性HBV感染和黄曲霉毒素暴露是肝癌发生的主要原因[2]。肝癌的临床治疗包括肝移植、手术切除、化疗、放疗、介入治疗和免疫治疗[3]。近年来，虽然肝癌的手术、射频消融和化疗取得了一定的进展，但由于肝癌的高复发率和转移率，其预后仍不理想[4]。目前临床上还没有一种很有效的手段能对肝癌的术后复发转移进行比较准确的预测，肿瘤标志物、腹部CT、腹部MRI等传统检查仍是监测术后复发转移的主要手段，但这些检查结果的滞后性使其不能对术后复发转移进行及时的预测；近年来，随着生物医学实验技术的不断进步，CTC的检测技术在不断的提高，其在临床应用中的价值逐渐凸显，细胞脱离原发肿瘤并通过血液流动被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell， CTC),早期发现和鉴定CTC对于监测和预防肿瘤转移的发生具有重要意义[5]。本研究通过比较原发性肝癌患者与肝脏良性病变患者外周血CTC表达情况，分析CTC对结肠癌的临床价值，同时对行肝癌根治手术患者的外周血CTC进行动态监测，并比较其与传统血清肿瘤标志物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein， AFP)对肝癌术后复发转移的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2014 年7 月—2016 年7月就诊于我院的134例原发性肝癌患者，其中男62例，女72例；平均年龄(56.23±7.19)岁；所有原发性肝癌病例均为初诊于我院的患者，均经病理检查证实为原发性肝癌。一般资料见表2。另选取72例同期在我院住院的肝脏良性病变患者做为对照，其中男38例、女34例，年龄(58.67±8.43)岁。在134例原发性肝癌患者中筛选出成功行肝癌根治术的患者，主要排除标准：无法完成根治性手术者；术中腹腔内多发转移或肝外转移者；手术失败者；合并其他脏器存在严重基础疾病者；既往在我院就诊前已经过放化疗或手术治疗的患者；既往有其他系统危重疾病或恶性肿瘤病史患者；有任何不适合抽血的患者。对这些患者进行为期2年的随访，每位患者每3～4个月复查血清肿瘤标志物、胸、腹部CT等,如CT提示远处脏器、局部淋巴结转移时, 再行局部穿刺等检查证实，将CT检查发现转移的时间定为转移发生时间；入组所有肝脏良性病变患者均为未经治疗的初诊患者。

1.2 研究方法

①标本采集：取所有患者的静脉血10 mL分为两份，一份2 mL，一份8 mL。2 mL静脉血无抗凝剂处理，在25℃下离心处理7 min后进行常规血清肿瘤标志物检测。另一份置入专用CellSave管，常温运输，严禁震荡，且必须在4 d内对该血液样本进行CTC检测。②血清AFP使用美国雅培AXSYM免疫化学发光分析仪和配套试剂检测。循环肿瘤细胞检测：利用外周血粒细胞表达CD45，即白细胞表面共同抗原，与磁珠结合后去除无关细胞，间接富集CTC。采用免疫荧光原位杂交技术(immunofluorescence in situ hybridizalion，imFISH)检测CTC。CTC阳性判定标准：将CEP8(8号染色体探针)>两个信号点，且CD45阴性、DAPI阳性的细胞定义为CTC。主要仪器：低速大容量离心机购自北京时代北利离心机有限公司，垂直混合仪购自宁波新芝生物公司，微型台式真空泵购自其林贝尔公司，脱色摇床购自其林贝尔公司，荧光显微镜购自蔡司公司，杂交仪购自杭州奥盛公司，电热恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。计数资料以[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线比较术前术后CTC表达情况对术后复发转移出现时间的影响，用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评估CTC、AFP对复发转移的诊断效能。

2 结果

2.1 两组患者CTC的检查结果

原发性肝癌组与肝脏良性病变组患者血清中CTC水平比较，见表1。原发性肝癌组外周血CTC≥1、5、10的阳性率分别为74.34%、62.17%、25.36%，高于结肠良性病变组(P<0.001)。

表1肝癌组与肝脏良性病变组CTC检测结果比较 n(%)

2.2 134例原发性肝癌患者临床病理参数比较

AFP≥110.0 μg/L定为阳性，CTC≥5定位阳性。单因素分析结果显示，CTC阳性与AFP阳性、淋巴结转移、肿瘤结节多少有关，与年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、肝硬化有无、TNM分期无关，见表2。

表2134例肝癌患者临床资料

2.3 术前和术后检测CTC对原发性肝癌术后复发转移关系

134例原发性肝癌患者成功手术者86例，除去失访患者后共70例患者成功随访，将术前CTC≥5，术后CTC≥5列为第一组；术前CTC≥5，术后CTC<5列为第二组；术前CTC<5，术后CTC<5列为第三组；术前CTC<5，术后CTC≥5列为第四组；第一组患者成功随访19例，术后发生转移17例；第二组患者成功随访35例，术后发生转移20例；第三组患者成功随访12例，术后发生转移3例；第四组患者成功随访4例，转移1例。四组患者术后转移的发生有统计学意义(P<0.05)，术前CTC≥5，术后CTC≥5组患者术后发生转移率高于术前CTC<5，术后CTC<5组患者，见图1。

图1 四组肝癌患者CTC表达情况与复发转移出现时间比较(P=0.001)

2.4 CTC与AFP和原发性肝癌术后复发转移关系

将AFP≥110.0 μg/L定为阳性，CTC≥5定位阳性，对成功手术者进行随访，分为CTC阳性组与AFP阳性组；CTC阳性组成功随访54例，术后发生转移37例；AFP阳性组成功随访40例，术后发生转移14例；两组术后转移发生时间有统计学意义，CTC阳性组术后发生转移率高于AFP阳性，见图2。

图2 CTC阳性组与AFP阳性组肝癌患者复发转移出现时间比较(P=0.002)

2.5 以ROC曲线计算CTC、AFP在转移复发预测的敏感度、特异度

CTC联合AFP对术后复发转移检测的敏感度、特异度高于任意单独一种指标检测的敏感度、特异度，CTC联合AFP检测对于原发性肝癌有复发转移有更好的评估效能，见表3。

表3单独与联合检测比较(%)

3 讨 论

转移是全世界癌症患者死亡的主要原因，据世界卫生组织估计，到2030年，每年因癌症发生转移而死亡的人数将超过2000万人[6]。CTC在癌症转过程中起重要作用，了解它们在癌症转移所起的作用可能有助于更好的治疗管理[7]。CTC来源于原发肿瘤和转移灶，并含有与原发癌预后和治疗相关的肿瘤分子特征的重要信息[8]。CTC不仅可用于研究肿瘤的生物学特性，还可克服传统组织活检的缺点，实时动态监测肿瘤变化情况[9]。AFP是肝脏在胎儿发育过程中产生的一种主要血浆蛋白，在原发性肝癌患者中可升高，AFP水平升高与肿瘤复发和预后不良有关，也被证明是监测肝癌治疗反应的有价值的工具[10]。

本研究对134例原发性癌患者和72例肝脏良性病变患者的外周血中CTC进行检测，结果显示原发性癌患者CTC检出率(CTC ≥1 阳性率)为74.34%，高于肝脏良性病变患者，两组差异有统计学意义(P<0.001)；同时对原发性癌患者不同疾病因素进行分析，结果显示CTC阳性与AFP阳性、淋巴结转移、肿瘤结节多少有关，与年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、肝硬化有无、TNM分期无关。

同时我们还对86例成功行肝癌根治术的患者进行了随访，除去失访患者后共有70例患者成功随访，结果显示术前CTC≥5，术后CTC≥5组患者术后发生转移的概率(89.47%)高于其它三组患者(57.14%、25.00%、25.00%)。生存曲线显示，术前CTC≥5，术后CTC≥5组患者，其术后复发转移的时间早于另外三组患者；进而说明，动态监测CTC对原发性肝癌患者术后复发转移具有一定的临床应用价值。

我们又进一步对比了CTC与AFP对原发性肝癌术后复发转移的预测价值，结果表明，CTC阳性组患者术后发生转移的概率(68.52%)高于AFP阳性患者(35.00%)。生存曲线显示，CTC阳性表达的患者中，其术后复发转移的时间早于AFP阳性表达的患者；进而说明，较传统肿瘤标志物AFP，CTC具有更显著的预测肝癌患者术后复发转移的价值，同时我们又采用ROC曲线评估了CTC、AFP及两者联合对术后复发转移的预测作用，结果显示两者联合检测其灵敏度、特异度较任意指标单独监测均升高。

综上所述，本研究对术前术后CTC进行了动态监测，结果表明，CTC在原发性肝癌患者中明显表达，相对于AFP，CTC对原发性肝癌术后复发转移有更显著的预测价值；两者联合监测可提高术后复发转移预测效果。本研究的不足之处在于只进行术前、术后两个时间点进行CTC的检测，若能对术后病人选取更多的时间点进行更加完善的CTC动态监测，相信一定能更好的对术后复发转移进行有效的预测，同时也只比较了其与AFP对原发性肝癌术后复发转移的优势，并未选取更多的肿瘤标志物，这是本研究存在的不足和应该加强之处。