吴茱萸碱通过阻滞细胞周期而抑制人骨肉瘤细胞增殖

徐绘华 苏文洲 陈存特 黄千峰 黄智通 郭奇峰

1 广州市第一人民医院(广州 510180) 2 广东省妇幼保健院(广州 511400)

骨肉瘤是儿童和青少年最常诊断的骨原发性恶性肿瘤[1- 2]。在小于24岁患者的发病率在全球范围内基本一致， 骨肉瘤患者男女比例约为1.40:1，在男性中比在女性中更常见[3]。骨肉瘤病因尚未完全明确，其中可能与患者特征相关的因素包括年龄，性别，种族，生长和身高，遗传和家族因素以及先天存在的骨骼异常。遗传畸变可能是发生骨肉瘤的重要因素之一[4]。在1970年之前，骨肉瘤的治疗主要取决于手术切除，导致5年生存率低于20%，到90年代，5年生存率增加至70%左右[5]。目前，用于治疗骨肉瘤的标准化疗方案为多柔比星、甲氨蝶呤加上顺铂等新辅助化疗组合[6- 7]。即使有了这些干预措施，骨肉瘤患者的临床治疗结果在近30年来没有得到明显改善。有效的化疗药物是提高患者临床治疗效果的重要途径，因此，迫切需要开发更多的高效化疗药物。

吴茱萸碱是传统中药吴茱萸中主要的成分，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等药理作用[8]。目前研究表明，吴茱萸碱具有广泛而强大的抗肿瘤活性，抗肿瘤谱包括胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌等[9]。国内外众多研究表明吴茱萸碱能显著抑制多种肿瘤细胞活性，其作用机制涉及细胞凋亡、诱导周期阻滞以及破坏相关膜蛋白等。但目前研究主要集中在肺癌、胃癌、肝癌、肾癌等领域[10-11]，极少有其对骨肉瘤作用的研究，吴茱萸碱在骨肉瘤的作用机制目前尚未清楚，在本文中我们利用体外细胞实验来探讨吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞增殖、周期的变化，为吴茱萸碱抗骨肉瘤提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤细胞株HOS细胞购自中科院上海细胞库；吴茱萸碱MedChemExpress(MCM美国)；MEM培养基、青霉素-链霉素双抗溶液(美国GIBCO公司)；细胞周期检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；TRIzol Reagent(Ambion)；逆转录试剂盒、扩增试剂盒(美国Takara)；胰蛋白酶(0.25% Trypsin、0.25% Trypsin-EDTA)(Gibco 加拿大)；结晶紫溶液(碧云天生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人骨肉瘤HOS细胞的培养条件为37℃、湿度为95%、CO2含量为5%的恒温培养箱环境。人骨肉瘤HOS细胞所用的完全培养基为含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的MEM培养基。细胞培养时隔天更换培养基，2 d传代1次，传代比例为1:2。

1.2.2 Hoechst- 33258荧光染色观察经不同浓度：吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞核的形态学变化：取对数生长期的HOS细胞，消化重悬细胞并计数，按2×105个/孔，将其种植于6孔板爬片，培养6～8 h待其完全贴壁，吸尽残余培养液，分别加入浓度为3、6、12 μmol/L的含吴茱萸碱的完全培养基[12]，实验对照组只加等体积完全培养基，48 h后吸尽液体，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液，PBS洗涤2遍。Hoechst- 33258染色液，染色5 min，去染色液，PBS洗涤2遍。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，将贴有细胞的盖玻片取出，让细胞面朝下接触封片液覆盖载玻片。荧光显微镜下观察并拍照，激发波长到350 nm，发射波长到460 nm。

1.2.3 细胞周期实验：常规观察并调整培养瓶内的细胞生长密度以及每瓶细胞状态，实验当天取处于对数生长期的骨肉瘤HOS细胞进行实验。按1×106个细胞/皿接种在6 cm直径的培养皿中，培养过夜，待细胞贴壁后，更换含有3 μmol/L 吴茱萸碱的完全培养基继续培养。 加药分别培养24、48、72 h后，消化计数得到5×105个细胞/管的细胞悬液，转移至流式管中，离心重悬并固定过夜。次日加入RNA酶和PI染色液避光孵育15 min。最后流式细胞仪上机检测，分析细胞周期变化情况。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 倒置显微镜观察骨肉瘤HOS细胞活力

每2 d细胞换液时显微镜下观察显示HOS细胞活力良好，细胞呈集落生长，部分融合成片(见图 1)。

2.2 Hoechst- 33258荧光染色观察经不同浓度吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞核的形态学变化

吴茱萸碱的不同药物浓度(0、3、6、12 μmol/L)作用于人骨肉瘤HOS细胞48 h，荧光显微镜下对照组细胞胞核完整，着色均匀，荧光弥散而黯淡；不同浓度吴茱萸碱处理组细胞，染色质凝聚，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，着色不规则，呈现细胞凋亡核碎裂等典型变化，而且随药物剂量增加而更趋明显(见图2)。

图1 倒置显微镜下培养48 h的骨肉瘤HOS细胞(A×100， B×200)

图2 吴茱萸碱作用48 h后Hoechst- 33258荧光染色结果(×200) 注：A. 对照组；B. 3 μmol/L；C. 6 μmol/L；D. 12 μmol/L

2.3 流式细胞术检测3 μmol/L吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞的细胞周期变化

基于上述Hoechst- 33258荧光染色的结果，我们选用3 μmol/L的吴茱萸碱处理后骨肉瘤HOS细胞，利用周期检测试剂盒对骨肉瘤HOS细胞进行染色。将未经吴茱萸碱处理的对照组细胞和给药培养不同时间的样品收集，PI单染后流式细胞仪上机检测，各组的周期变化结果如下：G0/G1期：对照组(51.12±2.13)%，给药组24 h(19.17±1.02)%、48 h(16.94±1.67)%、72 h(11.05±1.25)%，与对照组相比，72 h组(P=0.01、F=2.9)，差异有统计学意义；S期：对照组(32.92±0.73)%，给药组24 h(31.00±3.42)%、48 h(32.38±3.03)%、72 h(29.18±2.87)%，与对照组相比，72 h组(P=0.024、F=15.46)，差异有统计学意义；G2/M期：对照组(16.01±2.26)%，给药组24 h(49.82±0.62)%、48 h(50.67±2.80)%、72 h(59.56±1.97)%，与对照组相比，72 h组(P=0.1、F=1.32)，差异有统计学意义。分析上述结果发现：吴茱萸碱可诱导人骨肉瘤HOS细胞发生G2/M期阻滞，而S期变化不明显。说明吴茱萸碱可以抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，并阻滞细胞周期于G2/M期。(见图3)

图3 吴茱萸碱处理骨肉瘤HOS细胞周期变化注：A:人骨肉瘤HOS细胞流式细胞术检测结果；B:流式细胞术检测周期率统计图， **P<0.01， ***P<0.001 vs Con，n=3

3 讨 论

骨肉瘤作为一种来源于间叶组织的肿瘤，具有恶性程度高，临床病情进展快，转移早等特点，其好发于青少年长管状骨的干骺端，例如股骨下端、胫骨上端，比例约为2/3。虽然目前采用手术加新辅助化疗的方法，取得了较好的效果，术后五年生存率由之前的不足20%提高到了60%～70%，但治疗中还是面临许多新的问题，如化疗耐药，毒副作用等，特别是肺部及其他远处转移，患者预后极差，一般术后1～2年内死亡。因此，寻找或研发一种低副作用、无耐药性、疗效肯定的新型化疗药物来治疗骨肉瘤成为临床噬待解决的问题，而生物毒素近年来逐渐成为抗肿瘤药物领域研究的热点之一。

抗肿瘤药物发挥抗肿瘤活性有很多种方式，可以通过细胞毒作用使细胞发生坏死，或者通过诱导细胞发生凋亡、阻滞细胞周期等方式发挥相应作用。吴茱萸碱是一种吲哚类生物碱，在多种肿瘤观察到吴茱萸碱可诱导发生G2/M期阻滞，包括前列腺癌、乳腺癌等[13]。目前，肿瘤化疗药存在耐药的情况，吴茱萸碱对人多重耐药性肿瘤异种移植物的抗肿瘤活性优于紫杉醇。研究发现吴茱萸碱可以增加化疗耐药的乳腺癌细胞对阿霉素敏感性，而且对正常人外周血细胞几乎没有毒性[14]。由此可见吴茱萸碱有发展成为抗肿瘤药物的潜力。

在我们的实验中发现吴茱萸碱的不同药物浓度(0、3、6、12 μmol/L)作用于人骨肉瘤HOS细胞48 h，荧光显微镜下对照组细胞胞核完整，着色均匀，荧光弥散而黯淡；不同浓度吴茱萸碱处理组细胞，染色质凝聚，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，着色不规则，呈现细胞凋亡核碎裂等典型变化，而且随药物剂量增加而更趋明显。利用周期检测试剂盒对HOS细胞进行染色。将未经吴茱萸碱处理的对照组细胞和给药培养不同时间的样品收集，PI单染后流式细胞仪上机检测，各组的周期变化结果如下：G0/G1期：对照组(51.12±2.13)%、24 h(19.17±1.02)%、48 h(16.94±1.67)%、72 h(11.05±1.25)%；S期：对照组(32.92±0.73)%、24 h(31.00±31.42)%、48 h(32.38±3.03)%、72 h(29.18±2.87)%；G2/M期：对照组(16.01±2.26)%、24 h(49.82±0.62)%、48 h(50.6767±2.80)%、72 h(59.56±1.97)%。分析上述结果发现：吴茱萸碱可诱导人骨肉瘤HOS细胞发生G2/M期阻滞，而S期变化不明显。说明吴茱萸碱可以抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，并阻滞细胞周期于G2/M期。该实验结果与Liao等人发现吴茱萸碱主要通过阻滞细胞周期于G2/M期发挥其抗肿瘤作用结果一致[13-15]

总而言之，我们发现吴茱萸碱可以抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，而且随药物剂量增加而更趋明显,并显著阻滞细胞周期于G2/M期,为进一步研究吴茱萸碱抗骨肉瘤细胞作用奠定了前期基础。