钙离子-介孔硅复合物的制备及性能评价

丁 晟，魏晓慧，杨 焜，李 钒，田 丰

（军事科学院系统工程研究院卫勤保障技术研究所，天津300161）

0 引言

无论在战时还是平时，过度失血都是当前战争和院前急救中引起伤员死亡的主要原因。研究显示[1-3]，在过去150 a 中，战争中的死亡率仍然保持在20%左右，而当中超过90%的伤亡人员在到达野战医院之前就已经死亡，其中造成死亡的原因有一半是过度失血。由于应急救治必须在黄金时间10 min 内完成，所以在现场迅速控制出血对于最终转移到医院治疗至关重要。

介孔硅（MSN）具有独特的结构和良好的生物相容性，可以运用于人体。MSN 具有的大比表面积和孔容使其在创伤止血方面具有良好的性能，近年来得到广泛的应用。人工合成的MSN 具有大比表面积、多孔结构、高容积率等特性，因此具有很强的吸附能力，能够通过快速吸收血液中的水分从而浓缩局部创面的凝血成分，最终实现快速止血的目的。由于人工合成的MSN 可以保持成分可控的特性，并且其止血效果也更为显著，许多国内外学者对以MSN 材料为功能核心的止血材料开展了一系列的研究[4-6]。

钙离子作为参与凝血反应的13 种凝血因子之一，对凝血过程本身有着重要的影响。钙离子（凝血因子Ⅳ）可以促进凝血反应，并有助于诱导内源性凝血级联和其他凝血因子的激活和更新，加速产生足够数量的凝血酶以加速纤维蛋白的早期形成，催化血液中纤维蛋白原转化为纤维蛋白，有利于纤维蛋白的链式聚合和凝血的稳定性。而纤维蛋白可以形成血凝块，从而堵塞伤口，达到止血的目的[7-8]。

因此，本研究通过人工合成可控的MSN，稳定控制MSN 的孔径和粒径，在单纯MSN 材料基础上负载钙离子，从而增强MSN 的止血性能，并进行综合评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

正硅酸乙酯（TEOS）、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、正辛烷、赖氨酸、甲基丙烯酸甲酯（MMA）和偶氮二异丁基脒盐酸盐（AIBA）都来自百灵威公司。硝酸钙[Ca（NO3）2·4H2O]来自Sigma 公司。

透射电子显微镜（JEM-2100F，JEOL，日本），X射线光子能谱仪（D8 Advance，Buker，德国），傅里叶红外光谱分析仪（Nicolet 380，Thermo，美国），血栓弹力图仪（CFMS LEPU-8800，乐普，中国）。

1.2 样品制备

将300 mg CTAB 溶于96 ml 去离子水中，在整个过程中通过氮气清洗并持续搅拌1 h，温度保持在70 ℃，最终得到澄清溶液。整个实验中保持一直通氮气，加入9 ml 的正辛烷搅拌30 min 后，再加入3.5 ml的MMA、66 mg 赖氨酸、3 000 mg TEOS、0.84 mg的AIBA，以800 r/min 搅拌反应4 h，最终得到单相乳白色液体。冷却至室温后静置12 h，之后以15 000 r/min 离心15 min 进行纯化，并使用无水乙醇洗去多余的有机溶剂，在自然环境下以600 ℃煅烧5 h，最后得到MSN 基材。

将MSN 基材与0.5、1.0、1.5 mol/L的硝酸钙溶液混合搅拌，之后进行抽滤收集，在真空干燥箱烘干得到样品Ca0.5MSN、Ca1.0MSN、Ca1.5MSN。通过凝血实验选出具有最佳止血性能的混合浓度，并进行材料物化性能的表征及生物安全性检测。

1.3 材料凝血性能的评价和筛选

1.3.1 血栓弹力图仪测试

采用乐普公司生产的西芬斯®CFMS LEPU-8800血栓弹力图仪来测试样品的凝血性能。测试方法如下：在测试前，将样品放置于80 ℃的真空干燥箱进行干燥以去除水分。称取10 mg 样品粉末于小试管，加入1 ml 的抗凝全血并用旋涡混合器混合相同时间使其混合均匀。之后吸取340 μl 的混合物于37 ℃环境下加入凝血杯中，然后加入20 μl 的0.2 mol/L的CaCl2溶液，并立即启动血栓弹力图仪进行测试，得出血栓弹力图曲线。其中不加样品的抗凝全血作为空白对照组，每组样品重复测试3 次。

1.3.2 活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）测试

APTT 反映内源性凝血途径的激活状态，而PT与外源性凝血途径的激活状态有关，两者皆属于临床的基本血凝检测。

APTT 测试方法：在试管中加入0.1 ml APTT 试剂和0.1 ml 贫血小板血浆以及样品2 mg。在37 ℃水浴中孵育3 min 后，在试管中加入0.1 ml 预热的CaCl2（0.025 mol/L），同时开始测定APTT。

PT 测试方法：将0.1 ml 贫血小板血浆加入含有2 mg 样品的试管中，在37 ℃水浴中孵育3 min 后，在试管中加入0.1 ml 预热的PT 试剂，同时开始测定PT。

APTT 和PT 测试均是将不加样品的抗凝全血作为对照组，每组样品至少重复测试3 次。

1.3.3 体外全血凝固时间（CBT）测试

CBT 能够更加直观地反映样品的凝血性能，从而评价样品的凝血能力。CBT 测试方法：将20 mg的样品加入10 ml 的试管中，于37 ℃水浴中孵育3 min，加入1 ml 的抗凝全血并继续孵育1 min，之后在试管中加入500 μl 的0.025 mol/L 的CaCl2溶液。于水浴37 ℃环境下每隔15 s 倾斜试管并观察血液是否流动，直至将试管倾斜90°血液不再流动即为凝血，记录凝血时间。其中不加样品的抗凝全血作为空白对照组，每个样品重复测量3 次。

1.4 材料物化性能的表征

1.4.1 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）分析

测试前取少量样品置于乙醇中超声分散15 min，之后取超声分散后的悬浮液滴到载有碳膜的铜网上，晾干后采用日本JEOL 公司的JEM-2100F 型透射电子显微镜（工作电压200 kV）观察样品的结构。

1.4.2 X 射线衍射（diffraction of X-rays，XRD）分析

分析前将样品置于80 ℃烘箱干燥除去水分，用压片法制片。XRD 检测时采用Cu-Kα 靶（入射线波长λ=0.156 04），管流30 mA，管压30 kV。其中广角XRD 以每步0.02°的速度从5°到80°扫描，扫描速度为4°/min；小角XRD 以每步0.02°的速度从0.5°到10°扫描，扫描速度为4°/min。

1.4.3 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

使用KBr 压片法，先将样品置于80 ℃干燥箱充分干燥后，取少量样品以1∶100 的比例与KBr 在研钵中混匀后置于不锈钢压模中压片成型，之后采用红外光谱分析仪对样品进行FTIR 分析，在红外光谱分析仪中以分辨力0.09 cm-1、扫描范围4 000～400 cm-1观察样品对波谱的吸收情况。

1.5 生物安全性检测

1.5.1 血液相容性

通过溶血实验[9]来评价样品的血液相容性。将2 ml 抗凝全血（由3.8 wt%的柠檬酸钠水溶液抗凝剂与新鲜血液以1∶9 的比例均匀混合得到）与8 ml 无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）混合，以2 500g 离心力离心15 min 后移去上层液体，并用无菌PBS 洗涤下层的红细胞数次，直至上层清液为无色。将红细胞与无菌PBS 以1∶9 的比例均匀混合形成红细胞悬液。以1 mg 粉末样品与1 ml 红细胞悬液混合作为实验组，1 ml 的红细胞悬液作为阴性对照组，0.1 ml 红细胞和0.9 ml 无菌去离子水作为阳性对照组。37 ℃孵育1 h 后，将实验组和对照组高速离心15 min，吸取上层清液，用紫外分光光度计测量540 nm 波长的吸光度，并使用以下公式计算溶血率：

1.5.2 细胞毒性分析（CCK-8 染色）

通过CCK-8 染色[10]检测样品对内皮细胞增殖的影响来分析其生物相容性。同时为了分析样品浓度变化对细胞的影响，设置低浓度320 μg/ml 和高浓度640 μg/ml 来检测样品对细胞毒性的变化。将内皮细胞以10 000 个/孔接种于96 孔板中，每孔200 μl 培养24 h。分别加入200 μl 的320 和640 μg/ml 的样品，对照组每孔加入200 μl 的PBS，培养24 h。丢弃孔内液体，细胞用PBS 冲洗几次后，每孔加入100 μl无血清培养基和10 μl 的CCK-8 溶液，在细胞培养箱内培养1 h。采用酶标仪在450 nm 下检测吸光强度（去除背景光）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析，所有实验数据都用均数±标准差（x¯±s）表示，采用单因素方差分析比较多组间的差异，采用t 检验比较2 组间的差异，其中P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 材料凝血性能的评价与筛选结果

2.1.1 血栓弹力图仪测试结果

血栓弹力图仪是通过监测血液凝固过程中血凝块的黏弹性来诊断血液凝固的全面有效的方法。其中观测血栓弹力图仪与凝血相关的主要参数为R、α和MA。R 值为凝血反应时间，表示从凝血系统启动到纤维蛋白凝块开始形成的时间；α 值为凝固角，是从凝块形成点到曲线最大弧度作切线与水平线的夹角；MA 值代表最大振幅，表示血凝块的强度和硬度。各组血栓弹力图相关参数见表1。

表1 各组血栓弹力图相关参数

表1 的实验结果显示，钙离子的引入能够显著降低R 值，增大α、MA 值，表明钙离子的引入可以加快凝血速度，缩短开始凝血的时间以及加强血凝块强度，而随着钙离子的增加，R 值会上升，开始凝血时间变长，止血效果会下降。血栓弹力图如图1 所示。

2.1.2 APTT 和PT 测试结果

本研究通过检测APTT、PT 来判断材料是否激活内源性或外源性的凝血途径。

APTT 实验结果（如图2 所示）表明，MSN 能够有效地降低APTT 值，引入钙离子后APTT 值降低更多，但是增加钙离子，Ca1.0MSN、Ca1.5MSN 与Ca0.5MSN没有显著性差异，效果相近。止血效果的增强可能是因为钙离子本身是内源性凝血系统中第Ⅳ因子，可以加速凝血系统的启动。

PT 实验结果如图3 所示，相对于对照组，所有样品的PT 值均没有显著性差异，说明材料对外源性凝血途径没有影响。

APTT 和PT 实验表明，所有材料主要是激活内源性凝血途径来促进止血，对外源性凝血途径没有显著影响。

图2 不同组分MSN 的APTT 结果

图3 不同组分MSN 的PT 结果

2.1.3 CBT 测试结果

CBT 是一种能直观反映凝血性能的基础性检测，测试结果如图4 所示。所有材料均能有效降低CBT 值，同时引入钙离子后CBT 值显著降低，表明钙离子的加入对止血有促进作用，并且Ca1.0MSN 的CBT 最短，效果最好，与凝血实验结果一致，因此选用制备的Ca1.0MSN 材料进行进一步探究。

图4 不同组分MSN 的CBT 结果

2.2 材料的物化性能

2.2.1 TEM 分析结果

用TEM 分析不同组分MSN 的形貌结果如图5所示。合成的样品均具有相同尺寸的单分散球形，平均孔径约为12 nm，平均粒径约为50 nm。且颗粒表面和颗粒内部的孔道呈放射状，部分MSN 呈空心状。结果表明，钙离子的引入对样品的形貌影响不大，成功合成的样品具有较大的孔径，对止血具有促进作用。

图5 不同组分MSN 的TEM 图

2.2.2 XRD 分析结果

研究表明[11-12]非晶态MSN 的毒性要比晶态MSN的毒性低，而XRD 是用来表征介孔材料的常用手段，其中衍射峰是确认材料晶型和介孔结构的有力证据。各样品的XRD 图谱没有明显差异，如图6 所示。通过小角XRD 发现在约1°处只有一个峰出现，表明所有样品都是非晶态的介孔结构；广角XRD 只有一个峰出现在10～40°，没有其他具有晶体结构特征的衍射峰，说明钙以非晶态形式存在于介孔材料MSN的骨架中。因此，钙离子的引入对MSN 的结构没有影响。

图6 不同组分MSN 的XRD 图

2.2.3 FTIR 分析结果

为了检测筛选出的最佳效果样品的表面化学结构的变化，对样品进行了FTIR 分析。如图7 所示，由于钙离子的引入，在1 350 cm-1左右处出现了硝酸根的吸收峰（1 350～1 380 cm-1），此外Si-OH 峰（3 200～3 400 cm-1）的存在表明样品存在硅烷醇基团，并且其具有极强活性的羟基，可以脱氢生成阴性离子状态的SiO-，与离子进行结合。结果表明，MSN能够成功负载钙离子，并且引入离子后出现了硝酸根吸收峰，但其他峰没有明显变化，表明MSN 结构基本没有发生变化。

图7 不同组分MSN 的FTIR 图像

2.3 生物安全性检测结果

2.3.1 血液相容性检测结果

通过溶血率来评价材料的血液相容性时，止血材料的溶血率低于5%[13]才能认为血液相容性较好。测试样品的溶血率均远低于5%并且没有显著性差异，其中MSN 的溶血率为（2.6±0.3）%，Ca1.0MSN 的溶血率为（2.9±0.5）%，这表明钙离子的引入不会影响MSN的血液相容性。血液相容性实验结果如图8 所示。

图8 血液相容性实验结果图

2.3.2 细胞毒性检测结果

通过测得的吸光度值来判断活细胞的数量，从而评价材料的生物相容性。吸光度值越大，细胞活性越强。图9 表明MNS 材料拥有良好的生物相容性，能够促进细胞繁殖，且低浓度下增殖效果比高浓度下更好。

图9 不同浓度下样品对细胞增殖的影响

3 结论

本研究制备了一种有序的具有可控孔径的MSN纳米颗粒，并且将其负载钙离子，以增强止血性能。通过一系列实验，评价了其止血效果和生物安全性能。实验结果表明，优化后的Ca1.0MSN 能显著激活内源性凝血通路途径，促进凝血，并且具有良好的生物活性，拥有良好的细胞增殖效果。与MSN 相比，钙离子的引入可以提高MSN 的止血效果及生物活性，并且不会造成结构上的明显改变。因此，Ca1.0MSN 作为一种先进的止血材料具有很大的应用潜力，未来可应用在院前急救以达到快速止血的目的，在军事和民用创伤急救中也表现出优秀的止血性能。本研究的不足之处在于没有进一步探究混合硝酸钙浓度的影响，且共混的方式制备复合材料的稳定性有所不足。下一步研究方向是进一步细化分析硝酸钙浓度的影响，并且在制备MSN 时直接尝试引入钙离子，探究一步法制备复合材料的可行性。