HPLC法测定桃核承气汤中10种成分的含量

陈淮臣，何 利，石 亚，刘 文

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004)

桃核承气汤(THCQD)出自《伤寒论》，由桃仁、大黄、桂枝、甘草、芒硝组成[1]，是《古代经典名方目录(第一批)》所载的第一个方剂[2]。该方具有逐瘀泻热之功效，主治下焦蓄血证，对糖尿病、胰腺炎、妇科炎症等多种疾病具有一定治疗作用[3-5]。其研究目前主要集中在临床报道和药理药效[6-8]，质量方面的研究较少。本研究首先基于古籍记载制备桃核承气汤物质基准[9]，然后采用HPLC建立其中10种成分的含量测定方法，用以评价桃核承气汤的质量，为桃核承气汤现代制剂的研发提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 II型高效液相色谱仪、DAD型紫外-可见检测器(美国安捷伦公司)；BPZIID型电子分析天平(德国Satrorius公司)；科导SK8210HP型台式超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；101-3AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯，TEDIA)，磷酸(色谱纯，成都金山化学试剂有限公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 对照品

没食子酸(批号：180213)、芹糖异甘草苷(批号：181216)、甘草酸(批号：181025)、儿茶素(批号：181209)、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷(批号：190409)、大黄酚-8-O-葡萄糖苷(批号：190118)、大黄素-8-O-葡萄糖苷(批号：190118)、番泻苷A(批号：181219)对照品购自成都植标化纯生物技术有限公司。大黄酸(批号：110757-201607)、肉桂酸(批号：110786-201604)对照品购自中国食品药品检定研究院。

1.4 药材

5种饮片购自昆明菊花村药材市场，桃仁产地为河北，大黄产地为青海，桂枝产地为广西，甘草产地为新疆，芒硝产地为西藏，每种饮片3个批次，经鉴定各药材均符合2015年版《中国药典》的相关规定。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸对照品适量，加甲醇制成浓度分别为10.40、30.27、55.33、15.54、8.27、6.67、8.27、3.36、4.19、59.97 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 桃核承气汤物质基准浸膏粉

按《伤寒论》中桃核承气汤原方记载并结合文献进行多方面的循古考证[10]，其中桃仁(去皮尖)采用燀桃仁；桂枝(去皮)采用桂枝；甘草(炙)采用炒甘草，以1两等于13.8 g计，称取饮片，加纯净水1 400 mL，武火煮沸，文火微沸至500 mL，200目纱布双层过滤，减压浓缩，55 ℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，制得桃核承气汤物质基准(S1～S5)。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定桃核承气汤物质基准浸膏粉0.1 g，置于25 mL具塞锥形瓶瓶中，加 70%甲醇超声45 min(功率500 W，频率50 kHz)使溶解并定容至刻度，摇匀后经0.45 μm微孔滤膜滤过，以续滤液作为供试品溶液。

3 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.2%磷酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱，0～10 min，25%B；10～15 min，25%～34%B，15～20 min，34%B；20～22 min，34%～40% B；22～37 min，40%～48% B；37～40 min，48%～54% B；40～48 min，54% B；48～55 min，54%～63% B；55～60 min，63%～69% B；60～70 min，69%～75% B；70～72 min，75%～100%B；检测波长：254 nm；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。

注：1.没食子酸；2.儿茶素；3.大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷；4.芹糖异甘草苷；5.番泻苷A；6.肉桂酸；7.大黄酚-8-O-葡萄糖苷；8.大黄素-8-O-葡萄糖苷 9.大黄酸 10.甘草酸

图1 桃核承气汤(A)、混合对照品(B)样品HPLC色谱

4 方法学考察

4.1 线性关系考察

分别精密吸取不同体积的混合对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备不同浓度的混合对照品溶液，按“3”项下色谱条件进行测定，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，用最小二乘法进行线性回归，以计算线性方差和相关系数r，见表1。结果表明，10个成分在一定浓度范围内与峰面积呈较好的线性关系。

表1 桃核承气汤物质基准10种成分线性关系考察结果

4.2 精密度试验

取桃核承气汤物质基准浸膏粉(S1)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件连续进样6次，计算得到没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

4.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“3”项下色谱条件分别于0，2，4，6，12，24 h 进行测定，计算得到没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸峰面积的RSD均小于2.0%，表明样品在24 h内稳定。

4.4 重复性试验

取同一批桃核承气汤物质基准浸膏粉(S1)，同“2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按“3”项下色谱条件进行测定，计算得到没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸峰面积的RSD均小于2.0%，表明本方法重复性良好。

4.5 加样回收试验

精密称定6份同一批桃核承气汤供试品(S1)0.05 g，分别置入25 mL容量瓶中，分别加入各对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件依次测定，计算得到没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸的平均加样回收率分别为98.88%、98.11%、98.99%、97.85%、99.07%、101.52%、99.92%、97.44%、98.98%、99.51%；RSD分别为0.21%、2.31%、0.46%、0.68%、0.75%、1.88%、0.37%、0.31%、0.44%、0.39%，表明该方法的准确度良好。

5 样品测定

按“2.2”项下方法使用3个批次药材分别制备3批桃核承气汤物质基准浸膏粉(S1～S3)，按“2.3”项下方法将每批次物质基准浸膏粉各平行制备3个供试品溶液，按“3”项下色谱条件依次测定，求平均值，结果见表2。

表2 3批桃核承气汤中10种成分含量测定平均值 (mg/g，n=3)

6 结果与讨论

本研究采用高效液相色谱法，同时测定了桃核承气汤中没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、番泻苷A、肉桂酸、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸10种成分的含量，该方法有效、便捷，能够反映桃核承气汤的化学成分特征。