正交试验优选紫冬凝胶最佳提取工艺

李锦堂，王贤儿，关琴笑，谭娥玉，卢颖欣

(1.江门市五邑中医院/暨南大学附属江门中医院 药学部，广东 江门 529000；2.江门市五邑中医院 陈皮研究院，广东 江门 529000；3.广东药科大学，广东 中山 528400)

紫冬油为我院治疗皮肤烧烫伤、小儿湿疹、褥疮等皮肤疾病的有效制剂，已沿用40余年，深受医师推崇、患者好评且产值较大。原方由紫草、忍冬藤、白芷等组成，有清热解毒、消肿排脓之功，临床使用发现也有一定的破损肌肤修复作用。紫草作为原方君药，现代研究表明其主要成分紫草素、紫草宁及其衍生物为萘醌类化合物，具有抗病毒、抑菌、抗肿瘤活性等作用[1-3]。但因原方提取需经油炸提取后与蜂蜡、麻油等混合制成，制备工艺繁琐，且现代研究表明，在成分提取方面存在一些弊端，因此为提高制剂效能，方便患者使用，本课题将在保持中医药特色的基础上，采用现代制剂研究方法，对该制剂进行全面系统研究，以水凝胶作为剂型基质，以期将其改进成为既保持疗效又方便临床使用的新剂型——紫冬凝胶。本实验将采用正交试验研究方法，对该制剂的提取方法进行优化研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器与设备

LQ-C20002电子天平(五鑫衡器有限公司)；ME104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；WH-800超声波清洗机(济宁万和超声电子设备有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；HH-3A数显恒温三温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)。

1.2 药品与试剂

新疆紫草(1710001)(广州市岭南中药饮片有限公司佛山分公司)；忍冬藤(161101)(安徽汇仁堂中药饮片有限公司)；白芷(20170301)(国药集团冯了性(佛山)药材饮片有限公司)；左旋紫草素对照品(0769-9903)(中国食品药品检定研究院)；95%乙醇(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；蒸馏水(实验室自制)。

2 方法及结果

2.1 总萘醌测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定左旋紫草素对照品4.20 mg，加95%乙醇使溶解，并定容至10 mL，摇匀，即得浓度为0.42 mg/mL对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取处方药1份粉碎，精密称定，加入8倍量70%乙醇，超声30 min，过滤，分别取滤液10 mL，挥干乙醇，置于烘箱中60 ℃烘干4 h，放冷，称重。另分别精密吸取0.5 mL滤液于20 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，得到供试品溶液。

2.1.3 测定波长的选择 精密移取上述制备的对照品溶液、供试品溶液各1 mL，分别置入10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，定容，摇匀。随行试剂为空白对照组，照紫外-可见分光光度法于400～600 nm波长范围全程扫描。结果对照品及供试品均在516 nm处有最大吸收，且空白试剂对照均无干扰，故选择516 nm为测定波长。结果见图1-图3。

图1 左旋紫草素紫外吸收光谱

图2 供试品紫外吸收光谱

图3 阴性对照试验紫外吸收光谱

2.1.4 标准曲线的制备 分别精密量取浓度为0.42 mg/mL对照品溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，采用紫外-可见分光光度法进行测定。以左旋紫草素对照品溶液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，计算得回归方程：A=19.608c+0.003 8(r=0.999 9)，结果表明，供试品溶液浓度在0.005 04～0.050 4 mg/mL范围内，其吸收度线性关系良好。

2.2 提取方法的选择和单因素考察

2.2.1 权重系数法 以羟基萘醌总色素的含量和浸膏得率为综合指标进行评分，由于主要考察君药——紫草有效成分的提取工艺，羟基萘醌总色素的含量更为重要，因此，羟基萘醌总色素含量与浸膏得率的权重比为7∶3。

2.2.2 提取方法的选择 根据实际生产条件，对醇回流法、醇超声法、醇浸渍法3种方法进行优选确定，测定在不同提取方法下总萘醌的含量及浸膏得率，结果见表1。结果显示，有效成分羟基萘醌总色素的含量在醇回流提取条件下最低；浸膏得率约在4%～6%之间，3种方法相差不大；采用“2.2.1”项下的权重系数评分法，3种方法评价得分由高至低：乙醇超声法>乙醇浸渍法>乙醇回流法。根据实验结果，醇浸渍法和醇超声法评价得分相近，结合实际生产效率，最终选择醇超声法作为本研究的基本提取方法。

2.2.3 单因素考察 按“2.1.3”项的测定方法以及“2.2.2”项下筛选的提取方法，进行单因素水平考察，最终以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数设置L9(34)正交实验因素水平表(如表2)，实验研究发现超声提取温度应控制在(60±3)℃。

2.2.4 正交试验 以“2.2.3”项下L9(34)表进行正交试验，以羟基萘醌总色素含量及浸膏得率为综合指标，进行正交试验，结果见正交试验分析表3和方差分析表4。

表1 不同提取方法的实验结果

表2 正交试验因素水平

2.2.5 正交试验结果与方差分析 由表4可知，因素的主次为A>B>C>D，因素A、B有显著性差异，因素C、D没有显著性差异。结合极差分析，基于实验的效率及节约溶剂、时间、节能等方面的考虑，最终确定提取的最佳条件为A1B3C1D1，即70%乙醇、料液比1∶12、提取45 min、提取1次。

表3 正交试验结果分析

表4 方差分析结果

注：F0.05(2,2)=19.000，*显著性。

2.2.6 提取工艺验证 取处方药各3份，粉碎，精密称定，加入12倍量70%乙醇，超声45 min，过滤，分别取滤液10 mL，挥干乙醇，再置于烘箱中65℃烘干4 h，放冷，称重。另分别精密吸取0.5 mL滤液于20 mL容量瓶中，分别加入70%乙醇定容至刻度，得到供试品溶液。

按“2.1.2”和“2.1.3”项的方法，测定在最佳提取工艺下羟基萘醌总色素的含量及浸膏得率，结果见表5。

表5 最佳提取工艺验证

结果显示，羟基萘醌总色素平均含量为11.17 mg，RSD%为1.42%；浸膏得率平均为6.66%，RSD%为2.57%，表明正交试验优选条件具有较强的可操作性及稳定性。

3 讨论

3.1 有效成分含量测定方法的选择

紫冬凝胶原剂型为以蜂蜡和麻油等制成的油剂，由于自身使用的缺陷而被改进为水凝胶剂，该制剂为院内制剂，用量大，产值高，值得进一步研发。本实验根据实际情况，采用紫外分光光度法作为该制剂的含量测定方法，可操作性强、方法简单高效，亦可为该制剂的质量标准提高提供研究数据，方便日后药检工作。

3.2 温度对有效成分的影响

实验过程中发现，用乙醇回流法对紫草进行提取时，加热到一定温度，提取液颜色会由红色变成紫黑色，其供试品溶液的紫外吸收图谱在516nm处没有吸收峰，表明紫草中萘醌类色素在一定温度下会发生改变，对热不稳定，因此也提示对该制剂的生产过程中应注意温度的控制。本次实验发现，醇回流80℃时，紫草中萘醌类色素已处于不稳定的状态。在对乙醇超声提取工艺进行优化的过程中，考察了紫草在30～70℃乙醇超声环境下的萘醌类总色素含量，结果表明随着温度的升高，紫草中羟基萘醌总色素含量与浸膏得率均有增加；同时表明紫草中萘醌类总色素在70℃时仍可稳定存在。李晓瑾等[4]研究表明紫草素在50～70 ℃范围内的影响很小，在超过80 ℃后，紫草素含量快速降低。因此建议提取时候将温度稳定在79℃以下，本实验过程控制在(60±3) ℃。

3.3 提取方法的选择

在考察最佳提取方法的实验中，乙醇浸渍法综合评分虽稍低于乙醇超声法，但实际差别不大。乙醇浸渍法除去耗时这一缺点，在稳定性上比起乙醇超声法有较大的优势，且更节约能源，因此在时间充裕的条件下还可对乙醇浸渍法进行更加全面深入的研究。

查阅相关文献[5]可知，紫草素具有光不稳定性，且因羟基的存在，易被氧化，长时间置于空气中，紫草素的含量会下降。本课题的实验过程均没有在避光条件下进行，但在实验过程中，对密封无避光放置2天之后的紫草药液再次进行含量测定，对比发现羟基萘醌总色素含量无明显变化，故未采取避光的操作。实验中，超声过程均在密封条件下，且过滤与取样的时间较短，受氧化的影响较低，但在实际生产工作中，应避免长时间暴露于空气中。