绿孢链霉菌对不同煤阶煤的降解转化*

赵国俊 郭红玉,2

(1.河南理工大学能源科学与工程学院，454003 河南焦作；2.中原经济区煤层(页岩)气河南协同创新中心，454000 河南焦作)

0 引 言

煤炭的降解转化研究分为两方面，一方面直接从降解煤炭产物中提取有用物质，如微生物降解转化煤炭的产物可以直接作为植物生长的促进剂使用[1]；另一方面继续利用降解产物，在降解产物中加入厌氧微生物，生成甲烷等清洁能源[2]。目前，学者们主要通过化学和物理方式对煤进行处理以提高煤的转化效率[3-4]。其中，化学处理机理是通过打断煤大分子间的化学键，减小相互之间的作用力和螯合作用[5]。物理处理机理主要是提高菌群与煤的接触面和亲和性，加快煤的溶解和降解过程。部分微生物可以分解并利用煤产物，产生清洁能源，这被称为煤的微生物转化。大多数是通过微生物分泌产生胞外酶来降解煤，例如通过木质素过氧化物酶和漆酶等木质素降解酶实现煤液化、气化及溶解[6-8]。相对于物理化学处理，微生物处理具有工艺简单、反应条件温和、能耗低、环境污染小等诸多优点，成为了研究的重点[9-11]。煤炭的微生物转化研究始于20世纪80年代，FAKOUSSA[12]发现一些细菌能利用煤的有机提取液作为唯一的碳源，溶解部分天然煤。COHEN et al[13]发现白腐菌和真菌能使风化褐煤降解为液态物质。近年来，GONZALO et al[14]已经通过生产专用木质素降解酶来完成木质素的完全降解。影响煤炭降解转化效率的因素较多，如菌群结构、温度、pH值、Eh值、螯合剂和微量元素、培养方式等，但目前煤的生物转化现场试验最为关注的是煤阶、粒径与降解时间三个主要因素，因室内研究的目的是为现场煤层提供参考，降解期间采用静置培养方式得出的结论更有指导意义。

基于生物转化现场试验关注的主要因素，本研究以绿孢链霉菌为降解菌种，进行了不同转化条件(煤阶、粒径、降解时间)下的降解正交试验，并通过实验测试溶液的COD值、残煤的元素含量与煤的亲水性，分析绿孢链霉菌的降解作用对不同煤阶煤的影响。

1 实验部分

1.1 样品采集与制备

采集内蒙古伊敏褐煤(H)、山西马兰肥煤(F)和阳泉寺家庄矿无烟煤(W)，密封带回实验室磨成粉末，分别筛分出0.10 mm～0.15 mm，0.18 mm～0.25 mm和0.42 mm～0.85 mm的煤样。为避免煤样中微生物对实验结果产生影响，将煤样放入75%的酒精中15 min进行灭菌，之后放入60 ℃的干燥箱中干燥至恒重，保存备用。煤样的工业分析按照GB/T 30732-2014进行测定，结果见表1。

表1 煤样的工业分析

1.2 菌种活化与富集

绿孢链霉菌(Streptomycesviridosporus)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，菌种编号为CGMCC 4.1770，其生物危害程度为四类，需氧类型为好氧型。0038 ISP-2培养基：酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，葡萄糖4 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，调节pH值为7.3。

用0038ISP-2培养基活化绿孢链霉菌，将冻干粉涂在固体培养基表面，放入35 ℃的恒温箱中培养6 d～7 d，观察到菌落表面光滑呈灰白色，将活化后的菌种保存备用。绿孢链霉菌富集用液体培养基，为提高绿孢链霉菌降解煤样的效率，将配好的液体0038ISP-2培养基(无琼脂)放入121 ℃的高压灭菌锅(日本Hirayama公司)中灭菌30 min后，在超净工作台接种活化后长势较好的绿孢链霉菌，用棉塞将瓶口塞住防止杂菌污染，放到恒温培养箱中富集3 d，用于降解实验。

1.3 菌种的生长特征

菌种活化后，进行梯度稀释并接种等量的菌到液体培养基中，采用UV-5200型紫外-可见分光光度计在600 nm波长下对上清液进行吸光度测试，得到菌种的生长曲线(见图1)。

微生物生长一般分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。由图1可以看出，第1天～第2天为绿孢链霉菌的生长迟缓期；第2天～第3天为对数期，生长速率最快；第4天～第5天生长曲线呈现下降趋势；第6天开始进入相对稳定期；15 d后死亡率增加，进入衰退期。为提高微生物对煤的降解效果，选用第3天处于对数生长期的绿孢链霉菌。

图1 绿孢链霉菌生长特征

1.4 绿孢链霉菌对煤降解的正交试验

采用正交设计的方法研究绿孢链霉菌对煤降解转化的影响，各因素设有3个水平，因素水平见表2。

表2 实验因素水平表

实验为3因素3水平，不考虑相互影响，其自由度总和=(水平数-1)×因素数=(3-1)×3=6，不大于L9总自由度((9-1)=8)，选择正交表L9实施本次实验。每组设置3个平行样，将27个试管编成1组～9组，在超净工作台上向每个试管倒入1 g煤样与10 mL富集3 d的菌液，用棉塞塞住瓶口再放入35 ℃恒温箱中分别培养3 d，6 d和9 d，测定降解率。

1.5 绿孢链霉菌降解不同煤阶煤实验

将粒径为0.18 mm～0.25 mm的三种煤阶原煤H，F和W浸泡在绿孢链霉菌溶液中，放置于35 ℃恒温培养箱中分别培养3 d，6 d和9 d，测试COD值，之后将绿孢链霉菌降解9 d的褐煤、肥煤和无烟煤煤样分别编号为L-H，L-F和L-W，与原煤一起清洗、离心、干燥保存。

1.5.1 溶液COD测定

化学需氧量(chemical oxygen demand，COD)的单位为mg/L，直接反映溶液中有机物的质量，侧面反映绿孢链霉菌降解煤的程度。采用6B-200型COD速测仪，温度设定为室温～200 ℃，控温精度为(165±1)℃，计时范围为1 min～199 min，计时误差为10 min±0.1 s，使用时环境温度为-5 ℃～65 ℃。

1.5.2 元素含量分析

取保存的原煤及绿孢链霉菌降解后的煤样，按照GB/T 31391-2015进行元素分析，采用Thermo Scientific FLASH 2000 CHNS/O元素分析仪(标配32位固体进样器，可选配128位固体进样器或105位液体自动进样器，采用“动态闪烧-色谱分离”)确定样品中碳、氢、氮、硫和氧的含量。

1.5.3 固液接触角测量

取保存的原煤及绿孢链霉菌降解后的煤样，将煤样在40 MPa的压力下制成直径为50 mm，厚度约为1 mm的煤切片。采用JC2000C1接触角测量仪(滴定剂液滴距离样品10 mm，体积为3 μL)测量水、矿井水和KO溶液(阴离子型与非离子型按9∶1的体积比配制的表面活性剂)与煤的接触角，在不同位置测试3次并取平均值。

2 结果与讨论

2.1 正交试验

采用L9(34)正交表研究煤阶、粒径和降解时间3个因素对绿孢链霉菌降解煤降解率的影响，结果见表3。

由表3可知，降解率最高的煤阶为褐煤，肥煤与无烟煤的降解效果较差且相差较小，也可由极差R得知降解时间与粒径对降解率的影响较小。降解率最大的组合为A1B2C2(褐煤、0.18 mm～0.25 mm、6 d)。

SST是反映观测值变异的总平方和，分解为因素水平间变异SSA，SSB，SSC及实验误差4部分，自由度df是不受限制的变量个数，均方MS度量此样本的变异程度。对实验结果进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，因素A(煤阶)对降解率的影响显著，而因素B(粒径)与C(降解时间)对降解率的影响都不显著，可能是因为本次实验误差较大而且误差的自由度较小，使得检验灵敏度偏低，掩盖了降解时间与粒径的显著性。在可信度95%的情况下，煤阶的F值大于给定的显著水平标准(F0.05(2.2)=19)，而粒径和降解时间的F值小于给定的显著水平标准，说明在0.05的显著性水平下，煤阶对绿孢链霉菌降解作用有显著的影响，降解时间和粒径对绿孢链霉菌降解作用影响不显著。

表3 煤样的降解率

Note:ηmeans degradation rate；Tijmeans sum of all factors at a certain level；Xijmeans average ofTij；Rmeans range.

表4 方差分析

2.2 COD测定

收集降解期间的溶液，按照COD测定步骤逐步添加测试试剂，对不同溶液进行测试，结果见表5。

由表5可知，前3天，绿孢链霉菌对煤进行大幅度降解导致COD值升高；第3天～第6天，绿孢链霉菌进一步降解煤产生有机物质的速度大于其消耗速度；第6天～第9天，绿孢链霉菌降解煤速度小于其利用速度。分析第6天与第9天褐煤、肥煤与无烟煤的COD值，分别相差678.3 mg/L，606.2 mg/L和480.65 mg/L，反映出绿孢链霉菌最容易利用降解褐煤生成的有机小分子物质，其次是利用降解肥煤与无烟煤生成的有机小分子物质。

表5 不同煤阶煤各阶段的COD值

降解溶液的COD值由大到小的三种煤依次为肥煤、无烟煤、褐煤，分析可能在绿孢链霉菌继续降解时，肥煤虽然得到进一步降解，但是没有被更充分地分解成可溶于水的有机小分子物质[15]，而且绿孢链霉菌对各煤样的降解效果与利用率不同，宏观上表现为COD值的差异。

2.3 绿孢链霉菌降解对煤中元素含量的影响

取原煤与经绿孢链霉菌降解的煤样进行元素分析，比较煤样在不同条件下的碳、氢、氧、氮、硫的含量变化，结果见表6。

表6 各煤阶煤样的元素分析

由表6可知，与原煤相比，经绿孢链霉菌降解后三种煤中C和N元素含量都有不同程度的升高，其中L-W的C元素含量为81.44%，相比于原煤W的C元素含量49.73%，增幅达63.76%；L-H的N元素含量最高，为1.37%，相比于原煤H的N元素含量0.40%，增幅达242.5%。相反，O和S元素在降解煤中的含量都有不同程度的降低，推测是由于绿孢链霉菌降解过程中利用了煤中O元素维持生长繁殖，且绿孢链霉菌降解对煤有一定脱硫作用。与原煤相比，经菌种降解的煤的n(H)∶n(C)和n(O)∶n(C)值都有不同程度的减小。

2.4 煤的接触角

取用不同煤样制作的煤切片，通过量角法测试煤样与蒸馏水、矿井水和活性剂KO溶液的固液接触角，结果见图2和表7。

由表7可以看出，与各煤样表面的固液接触角由大到小的三种溶液均依次为蒸馏水、矿井水、KO溶液。相比原煤的固液接触角，经绿孢链霉菌降解煤样H的固液接触角变大，显示出强疏水性和差的润湿性，而F的固液接触角和W的固液接触角变小。蒸馏水与H的固液接触角由49.500°上升到67.250°，增加35.86%；与F的固液接触角由67.250°下降到63.250°，减小5.95%；与W的固液接触角变化最大，由99.995°下降到64.250°，减小35.74%。

图2 褐煤与水的固液接触角

表7 不同煤样降解前后的固液接触角

3 结 论

1)由正交试验可知，在影响绿孢链霉菌降解煤炭的三因素中煤阶占据主导地位，且煤阶为褐煤，粒径为0.18 mm～0.25 mm，降解时间为6 d时降解效果最好。

2)COD测试表明绿孢链霉菌降解煤炭的可行性，且绿孢链霉菌最容易利用降解褐煤生成的有机小分子物质，其次是利用降解肥煤与无烟煤生成的有机小分子物质，证实各煤阶煤样可以在绿孢链霉菌作用下进行降解。

3)绿孢链霉菌降解后各煤阶煤与原煤相比，C和N元素含量都有不同程度的升高，O和S元素在煤中的含量均降低，n(H)∶n(C)和n(O)∶n(C)也都有一定程度的降低。

4)相比原煤，经绿孢链霉菌降解的褐煤的固液接触角变大，而肥煤与无烟煤的固液接触角变小，显示出弱的疏水性，且与各煤样的固液接触角由大到小的三种溶液均依次为蒸馏水、矿井水、KO溶液。