3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异比较

敖秋桅 朱佳杰

摘要：【目的】比较吉富罗非鱼F5代（以下简称吉富F5代）、吉富罗非鱼F0代（以下简称吉富F0代）及奥尼罗非鱼对4种病原菌的抗病力差异，为罗非鱼苗种推广养殖提供参考依据。【方法】检测吉富F5代无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚链球菌和嗜水气单胞菌对吉富F5代的半致死浓度（LC50），并对3个罗非鱼种群进行人工腹腔注射感染4种病原菌，根据感染后的累计死亡率评估其抗病力差异。【结果】无乳链球菌Ia血清型对吉富F5代的LC50为2.14×105 CFU/mL，无链球菌Ib血清型对吉富F5代的LC50为2.14×106 CFU/mL，海豚链球菌对吉富F5代的LC50为2.14×107 CFU/mL，嗜水气单胞菌对吉富F5代的LC50为5.62×107 CFU/mL。3个罗非鱼种群感染病原菌后连续观察168 h发现，感染无乳链球菌Ia血清型菌株（HN016）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染无乳链球菌Ib血清型菌株（GX26）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染海豚链球菌菌株（GX05）的累计死亡率排序为吉富F0代>奥尼罗非鱼>吉富F5代;感染嗜水气单胞菌菌株（GX03）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼。方差分析结果显示，吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03后的累计死亡率均显著低于吉富F0代（P<0.05），与奥尼罗非鱼差异不显著（P>0.05）。【结论】经过连续5代选育后，吉富罗非鱼对无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚链球菌及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到顯著提高，并已接近奥尼罗非鱼的抗病水平。

关键词： 罗非鱼;抗病性;无乳链球菌;海豚链球菌;嗜水气单胞菌

0 引言

【研究意义】我国自20世纪90年代后期引进吉富罗非鱼并大面积推广养殖后，罗非鱼产业得到飞速发展，并逐步发展成为全球最大的罗非鱼养殖及出口国家（陈胜军等，2007;袁永明等，2013）。但近年来，由于养殖模式落后、水体环境恶化、种质退化及大规模疾病频发，养殖户承受了巨大经济损失，已严重制约罗非鱼产业的健康发展（王世表等，2016）。在罗非鱼的众多疾病中，以细菌性疾病的危害最严重，代表性病原菌有无乳链球菌、海豚链球菌和嗜水气单胞菌等，当前尚无有效的防治手段（孙永军，2014）。此外，养殖户为预防疾病暴发而滥用抗生素，导致商品鱼药物残留超标，水体环境严重污染，尤其是耐药菌株的产生导致病害频繁发生。已有研究表明，从种质上提高罗非鱼的天然抗病力以抵御病原菌入侵，是上解决病害防治及食品安全问题最有效的方法（纪荣兴，2008;朱佳杰，2019）。因此，研究罗非鱼对不同病原菌的抵抗力，对综合评价其抗病力具有重要意义。【前人研究进展】在水产生物抗病育种上，日本科学家成功获得虹鳟的抗病品种，并发掘了相关抗传染性胰腺坏死病毒（IPNV）的QTL标记（Ozaki et al.，2001）;挪威科学家对大西洋鲑进行家系育种及分子标记辅助抗病育种，建立了一批抗IPNV家系和易感病家系（Storset et al.，2007）。近年来，我国水产育种技术突飞猛进，大量学者围绕水产动物的高产、抗逆、抗病等性状开展品种选育研究工作。陈松林等（2008）通过人工感染牙鲆筛选、构建抗病力强家系，同时结合生长数据，获得了抗鳗弧菌病、生长快的新品种鲆优1号;此外，又以养殖群体和渤海野生群体的半滑舌鳎为基础群，通过家系构建和人工感染鳗弧菌方式，筛选获得了一批抗病力强、生长速度快的家系（陈松林等，2010）。孔杰等（2012）开展中国对虾生长和抗病的多性状复合选育研究，获得新品种黄海2号，其生长速度和抗病能力均得到明显提升。郑卫卫（2016）使用家系选育法构建一批抗鳗弧菌牙鲆家系，并通过育种值估计，发现抗病性能在亲子代得到较好遗传。白姗姗等（2017）开展镜鲤抗鲤疱疹病毒（CyHV-3）新品种选育工作，发现其F3代的抗病力已得到稳定提升。奥尼罗非鱼的抗病能力显著优于吉富罗非鱼，但存在生长速度偏慢、产苗率低、群体均匀度差等问题，影响养殖推广;吉富罗非鱼因具有生长速度快、产量高等优势已成为目前罗非鱼主养品种，但其抗病能力弱，急需改良（莫振明和林东年，2010;朱佳杰等，2015;祝璟琳等，2017）。朱佳杰（2019）自2012年起开展罗非鱼抗无乳链球菌病新品种选育工作，至今已选育5个世代，并于2018年通过全国水产原良种委员会审定，命名为壮罗1号罗非鱼，其养殖成活率比普通吉富罗非鱼提高15.2%～21.4%，生长速度较普通吉富罗非鱼提高9.1%～15.1%。【本研究切入点】罗非鱼品种繁多，种质资源较丰富，不同品种间的天然抗病力存在差异。在水产品种抗病选育中，通常采用特定单一的病原菌对育种对象进行人工感染，从中挑选出耐受力强的个体或家系。而罗非鱼病害监测结果显示，罗非鱼病害已从单一病原发病逐步过渡至多病原发病（国家罗非鱼产业技术体系，2016），但目前关于罗非鱼对多种病原菌的抗病力研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以吉富罗非鱼F5代（以下简称吉富F5代）、吉富罗非鱼F0代（以下简称吉富F0代）及奥尼罗非鱼为对象，分别采用自然环境下的常见病原菌无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚链球菌及嗜水气单胞菌进行注射感染，分析3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异，为壮罗1号罗非鱼的推广及后续新品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用吉富罗非鱼为2003年从国家级青岛罗非鱼良种场引进，2012年以抗无乳链球菌病感染能力和生长速度为目标进行选育，现已选育至F5代（吉富F5代），同时每年采用群体继代选育方法进行保种扩繁（吉富F0代）。奥尼罗非鱼由国家级广西南宁罗非鱼良种场繁育提供。挑选健康有活力、规格统一（平均重56.48±0.70 g）的3个种群罗非鱼各500尾，试验前用鸡血平板分离检测各种群罗非鱼是否携带无乳链球菌等病原。常规暂养8～10 d，提供充足氧气及保持水质清新。试验菌株分别为无乳链球菌Ia血清型菌株（HN016）、无乳链球菌Ib血清型菌株（GX26）、海豚链球菌菌株（GX05）和嗜水气单胞菌菌株（GX03），均由广西水产科学研究院鱼病室保存提供。

1. 2 半致死浓度（LC50）测定

使用血平板菌落计数法计算菌液浓度，并以10倍梯度对病原菌悬液进行稀释。各菌株的系列梯度浓度为：5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104和5.0×103 CFU/mL。挑选健康无外伤、规格统一的吉富F5代200尾，每个梯度浓度菌悬液腹腔注射10尾罗非鱼，注射量为0.2 mL/尾，对照组注射等体积无菌生理盐水，试验组设2次重复。每组单独饲养在容量为1 m3的大白桶中，保持水温30～31 ℃。定时观察鱼的发病和死亡状况，持续观察168 h。LC50参照Reed-Muench法进行计算。

1. 3 不同品系罗非鱼感染病原菌结果对比

选取规格无明显差异的吉富F5代、吉富F0代和奥尼罗非鱼，通过腹腔注射分别感染HN016（1.07×106 CFU/mL）、GX26（1.07×107 CFU/mL）、GX05（1.07×108 CFU/mL）和GX03（2.81×108 CFU/mL），菌株感染浓度根据上一步试验所得的LC50计算。每30尾为1组，每组设2次重复，每尾注射量0.2 mL，总计感染720尾鱼。3个罗非鱼种群均设30尾的对照组，注射等体积无菌生理盐水。注射感染后定时观察试验鱼死亡状况，持续观察168 h，及时清理死鱼，保持水质良好，水温控制在30～31 ℃。

1. 4 统计分析

试验数据使用SPSS 18.0进行统计及单因素分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 不同病原菌的LC50测定结果

吉富F5代感染不同浓度HN016后，病鱼眼睛和鳃盖充血，鱼体失去平衡转圈乱游，解剖后发现鱼体肝胰腺、肾脏和脾脏明显肿大，肠壁变薄。从图1可看出，吉富F5代感染不同浓度HN016后12 h开始出现死亡，而相应的对照组无死亡现象发生;感染后24～84 h为死亡高峰期，感染84 h后死亡鱼数逐渐减少，感染168 h后基本停止死亡;大于或等于1.0×106 CFU/mL的3个浓度感染吉富F5代的累计死亡率均超过50.00%。经Reed-Muench公式计算得知，HN016对吉富F5代的LC50为2.14×105 CFU/mL。

从图2可看出，吉富F5代感染不同浓度GX26后36 h开始出现死亡，发病状况与感染HN016相似，相应的对照组也未见死亡发生;感染后48～108 h为死亡高峰期，感染120 h后死亡鱼数逐渐减少;浓度大于或等于1.0×107 CFU/mL的2个浓度感染吉富F5代的累计死亡率均超过50.00%，低浓度（≤1.0×103 CFU/尾）GX26感染未出现死亡。经Reed-Muench公式计算得知，GX26对吉富F5代的LC50为2.14×106 CFU/mL。

从图3可看出，吉富F5代感染不同浓度GX05后24 h开始出现死亡，发病状况与感染HN016相似，相应的对照组也未出现死亡;感染后24～72 h为死亡高峰期，感染96 h后死亡鱼数逐渐减少;高浓度（≥1.0×108 CFU/尾）GX05感染吉富F5代的累计死亡率为60.00%，低浓度（≤1.0×103 CFU/尾）GX05感染未出现死亡。经Reed-Muench公式计算得知，GX05对吉富F5代的LC50为2.14×107 CFU/mL。

吉富F5代感染不同浓度GX03后，病鱼鱼体发黑脱鳞，皮肤溃烂，解剖发现鱼体内肝胰腺和肾脏肿大，感染后12 h开始出现死亡，而相应的对照组未出现死亡。从图4可看出，吉富F5代感染GX03后24～60 h为死亡高峰期，感染72 h后死亡鱼数基本稳定;高浓度（≥1.0×108 CFU/尾）GX03感染吉富F5代的累计死亡率超过50.00%，低浓度（≤1.0×103 CFU/尾）GX03感染未出现死亡。经Reed-Muench公式计算得知，GX03对吉富F5代的LC50为5.62×107 CFU/mL。

2. 2 4種病原菌感染3个罗非鱼种群后的死亡率比较

从图5可看出，3个罗非鱼种群注射感染HN016后12 h均开始出现死亡，死亡多集中在感染后96 d内，而各相应的对照组均未出现死亡。对发病鱼解剖观察发现，其病理特征均符合无乳链球菌的典型发病症状;对血琼脂培养基上接种病鱼脑组织和肝脏组织的优势菌落进行革兰氏染色镜检，也证实病鱼感染的病菌为无乳链球菌。感染HN016后168 h，3个罗非鱼种群的累计死亡率排序为吉富F0代（83.88%）>吉富F5代（50.00%）>奥尼罗非鱼（46.67%）。方差分析结果表明，感染HN016后吉富F5代的累计死亡率显著低于吉富F0代（P<0.05，下同），总体上略高于奥尼罗非鱼，但差异不显著（P>0.05，下同）。说明吉富F5代抗HN016感染能力已接近奥尼罗非鱼的水平。

从图6可看出，3个罗非鱼种群注射感染GX26后36 h开始出现死亡，死亡多集中在感染后120 h内。对病鱼脑组织进行取样培养及革兰氏染色镜检后确定为感染无乳链球菌。感染GX26后168 h，3个罗非鱼种群的累计死亡率排序为吉富F0代（70.00%）>吉富F5代（46.67%）>奥尼罗非鱼（43.33%）。方差分析结果表明，感染GX26后吉富F0代的累计死亡率显著高于吉富F5代和奥尼罗非鱼，但吉富F5代的死亡率与奥尼罗非鱼差异不显著。综上所述，经选育后吉富F5代对无乳链球菌（Ia和Ib血清型）的抗感染能力显著优于吉富F0代，已接近奥尼罗非鱼的抗病水平。

从图7可看出，3个罗非鱼种群感染GX05后24 h开始出现死亡，死亡多集中在感染后96 h内。对病鱼脑组织进行取样培养及革兰氏染色镜检确定为感染海豚链球菌。感染168 h后，3个罗非鱼种群的累计死亡率排序为吉富F0代（56.67%）>奥尼罗非鱼（43.33%）>吉富F5代（40.00%）。方差分析结果表明，感染GX05后24 h，3个罗非鱼种群的死亡率表现为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼，且相互间差异显著，但感染后168 h，3个种群罗非鱼的死亡率表现为吉富F0代>奥尼罗非鱼>吉富F5代，吉富F0代的累计死亡率显著高于奥尼罗非鱼和吉富F5代，而奥尼罗非鱼和吉富F5代差异不显著。可见，吉富F5代与奥尼罗非鱼对海豚链球菌的抗感染能力相近。

从图8可看出，3个罗非鱼种群感染GX03后12 h开始出现死亡，死亡多集中在感染后84 h内。对病鱼脑组织进行取样培养及革兰氏染色镜检确定为感染嗜水气单胞菌。感染GX03后168 h，3个罗非鱼种群的累计死亡率排序为吉富F0代（70.00%）>吉富F5代（50.00%）>奥尼罗非鱼（40.00%）。方差分析结果表明，感染GX03后168 h，吉富F0代的累计死亡率显著高于吉富F5代和奥尼罗非鱼，但吉富F5代的累计死亡率与奥尼罗非鱼差异不显著。可见，吉富F5代抗嗜水气单胞菌感染的能力与奥尼罗非鱼相近。

3 讨论

已有研究表明，我国南方罗非鱼主产区的罗非鱼病害逐年加剧，主要表现为以细菌性疾病为主引起大规模发病及死亡，其中链球菌病发生最严重，其次是嗜水气单胞菌（国家罗非鱼产业技术体系，2016;苏友禄等，2019）。吉富罗非鱼是我国罗非鱼养殖的主导品种，生长速度快，但抗病力弱，尤其对链球菌敏感，极易感染发病。本研究发现，HN016对3个罗非鱼种群的毒力最强，GX26次之，GX05和GX03的毒力较弱，而HN016为本课题组前期开展吉富罗非鱼抗病选育所选用的毒株，属于Ia血清型（沈夏霜等，2018）。Ia血清型为罗非鱼源无乳链球菌的优势血清型，流行范围广，时间长，而Ib血清型无乳链球菌主要在广东、广西及海南小范围流行（袁伟，2017）。本研究还发现，吉富罗非鱼感染HN016后发病快，病死率高，而感染GX26后发病较晚，病死率较低，说明吉富罗非鱼对不同血清型菌株的敏感性存在差异。强俊等（2012）采用2.95×10 8 CFU/mL海豚链球菌感染吉富和新吉富等罗非鱼品系，感染后12 h出现死亡，吉富和新吉富罗非鱼累计死亡率分别为36.67%和38.33%，与本研究罗非鱼的发病死亡时间相近，但本研究高浓度（1.0×108 CFU/尾）GX05感染后的死亡率达60.00%，与强俊等（2012）的研究结果差异明显，可能与吉富罗非鱼种群的种质差异有关，也可能与致病菌株的毒力相关。本研究中，吉富罗非鱼感染GX03后12 h已有死鱼出现，且死亡率急剧上升，说明吉富罗非鱼对该菌株非常易感，但感染108 h后死亡鱼数逐渐趋于稳定，发病鱼体表症呈发黑脱鳞、解剖后见肝脏肿大坏死，发病过程及症状与柯剑（2011）、杨宁等（2014）研究发现嗜水气单胞菌感染尼罗罗非鱼的症状相似，说明本研究开展嗜水气单胞菌感染吉富罗非鱼试验结果可靠。

在感染死亡率方面，本研究发现吉富罗非鱼感染HN016和GX26后，其F0代的累计死亡率显著高于奥尼罗非鱼和吉富F5代，吉富F5代的累计死亡率略高于奥尼罗非鱼，与柯剑（2011）、Huang等（2013）、祝璟琳等（2017）的研究结果一致;3个罗非鱼种群感染GX05后，吉富F0代的累计死亡率最高，吉富F5代的累计死亡率最低，与强俊等（2012）研究发现感染海豚链球菌后吉富及新吉富罗非鱼的累计死亡率显著高于尼罗罗非鱼的研究结果相似。Huang等（2013）、祝璟琳等（2017）研究表明，奥尼罗非鱼由于是尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼远缘杂交而得，具有明显杂种优势，在抗病、抗逆及雄性率等方面均显著优于吉富罗非鱼。吉富罗非鱼是由不同地理种群的尼罗罗非鱼种间杂交选育而成，由于持续对生长性状进行选择，其抗病、抗逆等性能已衰减。但本研究发现，吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03的累计死亡率差异均显著低于吉富F0代，且与奥尼罗非鱼的死亡率相近，说明经过5个世代选育后，与调控罗非鱼抗病性状相关的优势等位基因得到了很好的富集，其抗病性能已接近奥尼罗非鱼的抗病水平，也进一步验证了沈夏霜等（2018）对吉富F5代抗病和生长性能的评估结论。

4 结论

经过连续5代选育后，吉富罗非鱼对无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚鏈球菌和嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到显著提升，其抗病能力已接近奥尼罗非鱼的水平。

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（责任编辑 思利华）