云南三七根腐病病原细菌的鉴定

张晋豪 杨俊 姬广海 王彦芳 张荣琴 代真林 刘棋 魏兰芳

摘要：【目的】明确云南三七根腐病致病细菌的种属，为三七根腐病的综合防治提供科学依据。【方法】从云南省不同三七种植区采集三七根腐病植株，采用组织分离法进行病原细菌分离，通过柯赫氏法则验证病原菌的致病性，利用形态学、生理生化与基因序列分析相结合的方法明确病原细菌的分类学地位。【结果】采用组织分离法从发生三七根腐病的块根中共分离到200多株细菌，经室内组培离体筛选得到10株细菌能引起三七块根腐烂，其中1株细菌MA9对健康三七切伤组织的致病力最强，选取该株细菌进行后续研究。健康三七块根离体接种MA9菌液9 d后出现菌脓，块根开始腐烂变黑、变软，并伴随有恶臭味。将MA9菌株摇瓶发酵制备成OD600约0.5的菌悬液灌根接种到温室和田间健康三七植株上，均表现出与田间病株一致的症状：最初在芦头与芽基结合处出现褐色水渍状病变，随着病变不断扩展最终导致三七地下块根顶芽腐烂和地上部植株死亡。在田间接种后发病的三七块根重新分离到该病原细菌。利用Biolog微生物鉴定系统和16S rDNA序列比对结果均显示MA9菌株与产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indoloqenes）为同一种属。【结论】引起云南三七根腐病的致病细菌为产吲哚金黄杆菌。这是国内首次报道该菌能引起三七根腐病。

关键词： 三七根腐病;产吲哚金黄杆菌;病原细菌鉴定;云南省

0 引言

【研究意义】三七[Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen]属五加科人参属多年生植物，是我国特有珍贵中药材，也是云南省重要的生物资源（宫峥嵘，2014）。因三七生长环境独特且生长周期较长，易诱发各种病害，其中以根腐病最严重（王勇等，2003）。连年种植三七会加重根腐病的发病率，根腐病常年造成三七损失5%～20%，严重者在70%以上，甚至导致绝收（冯光泉等，2003）。目前三七根腐病已成为云南三七产业发展的瓶颈，严重制约三七品质和产量的提升。因此，明确引起三七根腐病的有害细菌，并针对病原靶标进行对症防治，对促进云南三七产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前对三七根腐病病原菌鉴定的研究较多，大多数报道三七根腐病是由病原真菌侵染引起。20世纪50年代最早记载三七根腐病病原菌为藤草镰孢（Fusarium scirpi）（蒋妮等，2011）;缪作清等（2006）报道引起三七根腐病的病原真菌类群主要包括毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、黃腐柱孢菌（C. didynum）、腐皮镰刀菌（F. solani）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、恶疫霉（Phytophthora cactorum）、草茎点霉（Phoma herbarum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）;毛忠顺等（2013）报道三七根腐病病原是一种茎线虫（Ditylenchus sp.）;汪静等（2015）报道引起三七根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄病镰刀菌（F. solani）和链格孢菌（Alternaria alternata）;Mi等（2017）报道土赤壳属（Ilyonectria mors-panacis）能引起三七锈腐病;董鲜等（2018）报道尖孢镰刀菌（F. oxysporum）为三七根腐病的重要致病菌，该菌可影响三七植株生长、光合作用及水分利用。近年来，还出现关于人参属根腐病病原细菌的报道。Lei等（2017）报道假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）与镰刀菌属（Fusarium sp.）、丝核菌属（Rhizoctonia sp.）的复合侵染会加剧三七根腐病发生;Li和Han（2017）首次报道普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）可引起人参属根腐病;李纪潮等（2019）报道三七根腐病3种变形门致病细菌假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）、无色杆菌（Achromobacter marplatensis）和产碱菌属（Candidimonas sp.）。【本研究切入点】目前，有关人参属根腐病病原细菌的报道较少，关于金黄杆菌属细菌能侵染三七植株引发根腐病的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】对云南省三七根腐病病根组织进行病原细菌分离培养和致病性测定，并采用形态学、生理生化和分子生物学等方法明确其致病细菌的分类地位，以期为三七根腐病的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集 样品采自云南省文山州、曲靖市、红河州和昆明市等三七种植地。将发生根腐病植株的腐烂块根置于采样袋中，带回实验室进行病原细菌的分离培养。

1. 1. 2 培养基 NA培养基：葡萄糖/蔗糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、牛肉浸膏3.0 g、酵母浸膏1.0 g、琼脂20.0 g，pH 7.0，蒸馏水1000 mL;KB培养基：蛋白胨20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO4 1.5 g、琼脂17.0～21.0 g、甘油10 mL，pH 7.0，蒸馏水1000 mL;LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g，pH 7.0，ddH2O 1000 mL;Bug琼脂培养基（美国Biolog公司）。

1. 2 样品的分离和纯化

采用组织分离法进行病原细菌分离（Dong et al.，2016）：取病健交界处病组织（切成5 mm×5 mm小块），用75%乙醇溶液表面消毒1 min，无菌水冲洗3次后用灭菌吸水纸吸干水分，将病组织切下的小块研磨捣碎后加入装有45 mL无菌水的100 mL三角瓶中，26 ℃下160 r/min摇床振荡20 min后取出静置5 min，通过梯度稀释成10-1～10-5，在NA、KB和LB固体培养基上依次按低浓度向高浓度进行涂布，28 ℃恒温培养。

1. 3 病原菌致病性筛选及测定

1. 3. 1 室内组培离体筛选 将保存的菌株在NA培养基上活化培养3代。刮取菌落于NA液体培养基中培养至菌液浓度为OD600≈0.5（约3.0×108 CFU/mL），菌液稀释20倍接种于健康三七块根切口（位于三七块根靠近芦头的1/5处），每株菌株进行3次重复致病性筛选。以健康三七块根切口接无菌水为对照。接种完成后于28 ℃恒温培养，接种9 d后统一记录各菌株对健康三七块根的危害程度，进行病原细菌初步筛选。

1. 3. 2 温室灌菌致病性验证 取室内离体切伤初筛的细菌，菌悬液稀释10倍后制成100 mL菌悬液，采用灌根法浇灌于健康三七根部，无菌水作对照，每处理3次重复。接种50 d后统计块根腐烂程度。

1. 3. 3 高光环保型标准化设施荫棚三七致病性验证 基于室内离体切伤和温室移栽灌菌两次筛选后的细菌，再进行田间灌菌验证试验。试验在云南农业大学大河桥三七种植基地高光环保型标准化设施荫棚内进行，验证方法同1.3.2，采用灌根接种法将菌悬液进行浇灌接种，每隔15 d接种一次，每处理接种30株，每处理3次重复。接种60 d后取样调查。

1. 4 病原菌生理生化鉴定

病原菌生理生化鉴定采用MicrostationTM V4.01系统（美国Biolog公司）。将供试菌株的单菌落划十字接种在Bug培养基上，28 ℃恒温培养24 h;用接种液配制成细菌悬浮液（浊度仪测定菌悬液的浊度约为90%），于Biolog GN微孔板中每孔加入150 μL菌悬液，使用微生物鉴定仪进行细菌的鉴定分析（谢关林，2000）。

1. 5 病原菌分子生物学鉴定

细菌基因组DNA的提取采用DNA提取试剂盒[DP302-02，天根生化科技（北京）有限公司]，其步骤按说明进行操作。以原核生物保守基因16S rRNA引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行扩增（杨霞等，2008）。将PCR产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果上传至GeneBank核酸数据库进行同源性比对分析，运用MEGA 7.0构建系统发育进化树以明确病原菌的分类学地位。

2 结果与分析

2. 1 病原菌分离及其致病性测定结果

2. 1. 1 病害症状 三七根腐病常见于每年7—8月，恰逢云南省处于高温高湿，为病害高发季节。病害发生时三七植株萎蔫，叶片发黄变软，基部發黑;病害发生严重时叶片脱落，茎秆枯萎腐烂，植株轻轻拔起茎秆即断，地下块根仍腐烂埋在土里，芦头处颜色发黑腐烂直至整个根部腐烂（图1-A）。

2. 1. 2 病原菌分离及筛选 从不同地区三七根腐病病组织上分离到500多株细菌，剔除重复后剩余200多株。经室内组培离体筛选，最后获得10株细菌可在室内引起三七离体组织块根腐烂。筛选过程中发现健康三七接种其中1株细菌MA9后切伤组织的发病程度最严重，因此选取该株细菌进行后续研究。

2. 1. 3 病原菌致病性测定 室内离体接种MA9菌悬液测定结果显示，健康块根切伤接入MA9菌悬液9 d后出现菌脓，块根开始腐烂变黑、变软（图1-C），并伴随有恶臭味，而接种无菌水的三七块根并无症状（图1-B）;温室灌菌验证试验结果显示，三七接种MA9菌悬液50 d后，拔起块根发现块根与茎秆连接处颜色变为黑褐色，块根变得皱缩稍软，轻轻按压有菌脓出现（图1-D）。田间三七灌MA9菌悬液2个月后，发现有60%的三七块根发生根腐，芦头与芽基结合处出现褐色水渍状病变，随着病变不断扩展最终导致三七地下块根顶芽腐烂和地上部植株枯萎死亡（图1-E）。连根拔起发现芦头处颜色变黑，出现断芽和少芽现象，接入MA9菌株的块根与健康块根相比变得皱缩，少量伴随创口（图1-F和图1-G）。对接种后的发病块根芦头重新分离进行柯赫氏法则验证，再次获得相同的病原细菌，证明MA9菌株即为三七根腐病病原细菌。

2. 2 病原细菌形态学特征及培养性状

MA9菌株在NA培养基上培养24 h后形成黄橙色，略带黏性，菌落呈半透明状，圆形（直径1～2 nm），边缘整齐，中部稍有隆起，表面光滑有光泽的菌落（图2-A），拉丝结果显示为革兰氏阴性菌。在NA培养基中培养好的MA9菌落上滴加3% KOH溶液后1～2 s，菌落颜色由黄橙色变为红色（图2-B）。

2. 3 病原菌生理生化鉴定结果

将MA9菌悬液接种到含有95种不同碳氮源的Biolog GN微孔板中，28 ℃恒温培养箱培养24 h后，用Biolog微生物鉴定仪测定MA9菌株对碳氮源的利用情况，并与数据库中的标准细菌菌株进行比较。结果（图3）表明，MA9菌株在Biolog GN微孔板上培养24 h后与数据库标准菌株产吲哚金黄杆菌（Chry-seobacterium indologenes）相似程度高，相似系数为0.570，与产吲哚金黄杆菌相似值为98%，对碳氮源的利用结果基本一致。

Biolog GN微生物鉴定仪读板结果（表1）表明，MA9菌株能利用淀粉、吐温80、D-果糖、α-D-葡萄糖、麦芽糖、松二糖、柠檬酸、丙酸、胸腺嘧啶核苷和D，L-α-磷酸甘油等40种碳氮源，而在N-乙酰基-D半乳糖胺、α-D-乳糖、D-葡萄糖酸、D，L-乳酸、羟基-L-脯氨酸和6-磷酸葡萄糖等16种碳氮源利用上可变。不能利用D-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-果糖、乳果糖、D-甘露醇、2-氨基乙醇和D-丙氨酸等39种碳氮源。

2. 4 16S rDNA序列测定和系统发育分析结果

以MA9菌株的总DNA作模板，使用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，测序结果显示MA9菌株（GenBank登录号MK418541.1）与C. indologenes最相关，同源性为99%。将扩增获得的16S rDNA序列与GenBank中已公布的产吲哚金黄杆菌16S rDNA序列进行比对分析，并构建系统发育进化树。由图4可看出，MA9菌株与登录号KT151112.1和KT151113.1的 C. indologenes菌株亲缘关系最近，但与金黄杆菌属其他种的菌株均存在较大遗传差异。因此，确定引起云南三七根腐病的病原菌为产吲哚金黄杆菌。

3 讨论

三七根腐病是危害严重的土传病害，一旦发生对三七品质及产量均有较大影响。三七根腐病病原菌较复杂，引起三七根腐病的病原真菌前人已有较多报道，如尖孢镰刀菌、毁灭柱孢菌、茎点霉菌和链格孢菌等，但细菌引起的三七根腐病报道相对较少。郑光植和杨崇仁（1994）认为根腐病是一种细菌性病害;罗文富等（1999）首次提到细菌中的假单孢杆菌能与一些病原真菌复合侵染导致三七加快腐烂;官会林等（2005）认为三七根腐病与细菌中的厌氧菌密切相关。细菌可能在三七根腐病中扮演重要角色，因此不能忽视对三七根腐病有害细菌的存在，这些细菌可能会加速三七根腐病的发生，应明确对三七根腐病存在致病性的细菌种属。

本研究分离获得三七根腐病病原细菌产吲哚金黄杆菌MA9菌株。产吲哚金黄杆菌于1992年首次从豹蛙的组织和血液中分离获得（Olson et al.，1992），国外学者在羊奶中亦分离到产吲哚金黄杆菌（Callon et al.，2007），该菌作为条件致病细菌能引起水生动物如中华鳖、鲭鱼和乌鳢发病（Boran et al.，2013;王鑫毅等，2016;杨移斌等，2018）。产吲哚金黄杆菌被人们认知是作为罕见的人类机会性致病菌，被报道是引起腹膜炎和肺炎等的病原体（Aykac et al.，2016;Mukerji et al.，2016）。而MA9菌株是否也会作为一种机会性病原菌引起人或动物患病还有待进一步验证。产吲哚金黄杆菌作为植物病原细菌鲜有报道。刘缨等（2017）報道金黄杆菌属PYR2可促进棉花种子萌发及幼苗生长。说明产吲哚金黄杆菌的功能较复杂，可能与微生物所处的环境条件、地理位置、作物种类和致病型小种等有关。为进一步探究产吲哚金黄杆菌在田间引起三七根腐病，本课题组对发生三七根腐病的根际土壤细菌进行分离鉴定，发现从发生根腐病植株的根际土壤中也能分离到产吲哚金黄杆菌菌株，致病性测定结果表明该菌能引起健康三七发生根腐病。说明产吲哚金黄杆菌的确可作为病原菌引起三七根腐病，但产吲哚金黄杆菌侵染三七致病的具体原因仍需进一步探究。

本研究在云南地区首次发现产吲哚金黄杆菌能引起三七根腐病。因此，后续在云南三七根腐病发生区域应实时监测该病原菌在土壤中的丰度（如利用qRT-PCR或土壤微生物高通量测序技术进行监测），密切关注该菌在三七根腐病地区的发展动态，进行病害暴发的预警、预测，提前做好有针对性的防治措施，为不同地区引起三七根腐病病害的生物防治提供参考。目前，针对三七根腐病病原细菌产吲哚金黄杆菌的拮抗生防菌发掘及利用不同生防菌组合协同控制三七根腐病的研究工作已经开展，期望能为三七根腐病的生物防治打下基础。

4 结论

从三七根腐病病根组织上分离获得产吲哚金黄杆菌MA9菌株，柯赫氏法则验证MA9菌株对三七表现致病性，表明引起云南三七根腐病的病原细菌为产吲哚金黄杆菌。这是国内首次报道产吲哚金黄杆菌能引起三七根腐病。

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（责任编辑 麻小燕）