本土优良酿酒酵母的酿造学特性

郑海武,雷蕾,李正英,赵雪平,张美枝,李婷,黄海英,李晓娟,王春燕

(内蒙古农业大学 职业技术学院，内蒙古 包头，014100)

我国是世界葡萄酒消费增长速度最快的国家，人均葡萄酒消费量居世界前列[1]。中国已经逐渐成为葡萄酒生产和消费大国[2]。葡萄酒的酿造关键在于葡萄原料、工艺及发酵菌株，我国具有多个优良的酿酒葡萄产区及成熟的发酵酿造工艺，目前我国葡萄酒酿造多采用进口菌株，提高了酿造成本，降低了本土葡萄酒特色。我国的酿酒葡萄产区具有多样性，葡萄种植历史同样比较悠久，为我国野生酵母筛选提供了宝贵的自然菌种库，挖掘本土特色酿酒酵母具有一定的研究意义。

在葡萄酒酿造中，发酵酵母应当具备优良的酿造学特性，嗜杀性反应其抵抗外界攻击保真发酵正常进行的能力[3-4]，产硫化氢特性是酵母发酵过程产硫化氢多少的能力，硫化氢具有不良风味影响葡萄酒感官品质[5]，产泡性是酵母在发酵过程中产气量的多少，产气过多导致皮渣上浮、溢罐、爆罐等问题。絮凝性是酵母黏附成团沉降的特性，酵母沉降在发酵后期有利于酒的澄清及后发酵的管理[6-7]。模拟发酵系性能是酵母能够发酵酒的基本酿造学测定。课题组从全国多个酿酒葡萄产区进行采样筛选酿酒酵母菌，得到106株酵母菌，通过起酵速度、发酵速度、耐酒精能力、耐SO2、耐高糖等试验优选得到4株优良酿酒酵母[8]。本实验通过对4株本土筛选酿酒酵母菌与商业酿酒酵母菌进行酿造学特性研究对照，以期挖掘出能够满足优良酵母菌酿造学特性的酿酒酵母。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

S12酵母菌,从种植于山东高密的梅鹿辄葡萄果实上分离；S21酵母菌，从种植于山东平度的京亚葡萄果实上分离；Q12酵母菌，从种植于山东平度的早霞玫瑰葡萄果实上分离；WJ1酵母菌，从内蒙古乌海农家的发酵醪液中分离，由内蒙古农业大学职业技术学院食品系菌种库提供。

对照菌株为法国诺蒙集团XR (Excellence XR)及DS(Excellence DS)，安琪酵母股份有限公司CECA及CEC01。敏感菌株S.cerevisiae1296，中国食品发酵工业研究院有限公司。

1.1.2 试剂配制

YEPD-MB培养基(g/L)： 葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，亚甲基蓝0.03，琼脂20。

柠檬酸磷酸盐缓冲液：0.1 mol/L 柠檬酸9.6 mL，0.2 mol/L Na2HPO40.4 mL；

去絮凝缓冲溶液：50 mmol/L柠檬酸钠，5 mmol/L EDTA，pH 3.0；

絮凝缓冲液：50 mmol/L柠檬酸钠，20 mmol/L CaCl2，0.1 mol/L pH 2.2柠檬酸。

1.1.3 仪器与设备

STARTER3100精密pH计， 奥豪斯仪器有限公司；SA2202S-CW电子天平， 德国赛多利斯；TU1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析仪器厂；DK-8IIA数显恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；LRH-70生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DL-1电热炉，北京市永光明医疗仪器有限公司；VD-1320超净工作台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司；SX-700立式压力蒸汽灭菌锅，北京世贸远东科学仪器有限公司；KS4000ic 控制型摇床培养箱，德国IKA仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酒酵母菌株的嗜杀性特性对照

将唐莹莹[8]筛选得到的4株优良发酵特性的本土酿酒酵母S12、S21、WJ1、Q12与4株商业酿酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分别制成菌悬液,无菌环境操作,吸取200 μL菌悬液接种到10 mL YPD液体培养基中，28 ℃培养箱中培养24 h。同等条件活化传至3代。将敏感菌株S.cerevisiae1296菌粉置于5 mL YPD液体培养基试管中，在28 ℃培养箱内活化48 h，然后用生理盐水稀释至107CFU/mL，稀释的敏感菌株S.cerevisiae1296涂布于YEPD-MB培养基上，采用牛津杯抑菌法，以4株本土优良酵母与4株商业酵母作为抑菌剂在28 ℃培养箱中培养48 h，观察并测定酵母菌株周围蓝色的死菌带，测定抑菌圈(包括菌落)直径与菌落直径的差值表示抑菌圈大小[9]。

1.2.2 本土酿酒酵母菌株的产硫化氢试验

将唐莹莹[8]筛选得到的4株优良发酵特性的本土酿酒酵母S12、S21、WJ1、Q12与4株商业酿酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分别制成菌悬液，无菌环境操作，吸取200 μL菌悬液接种于10 mL YPD液体培养基中，28 ℃培养箱中培养24 h。同等条件活化传至3代。将活化后的菌液点样于BIGGY培养基上，将接种后的BIGGY培养皿置于28 ℃的培养箱中培养4 d，观察菌落颜色。

1.2.3 本土酿酒酵母产泡性

将唐莹莹[8]筛选得到的4株优良发酵特性的本土酿酒酵母S12、S21、WJ1、Q12与4株商业酿酒酵母XR、DS、CEC01、CECA分别制成菌悬液,无菌环境操作,吸取200 μL菌悬液接种10 mL YPD液体培养基中, 28 ℃培养箱中培养24 h。同等条件活化传至3代。采用平板计数法，计算菌液浓度后，将菌液浓度稀释至5×106CFU/mL，取稀后的菌悬液200 μL接种于10 mL YPD液体培养基中，并置于28 ℃培养箱中，静置培养24 h。每4 h测量1次泡沫高度，记录24 h内产泡沫最高高度[10]。

1.2.4 本土酿酒酵母絮凝特性

参照BONY等[11]的方法并稍作修改。将生长中期的4株本土酿酒酵母和4株商业酿酒酵母的菌液，分别用去絮凝缓冲液和无菌水洗涤2遍，置于絮凝缓冲液中，于600 nm处测定其吸光值(A)。将絮凝缓冲液置于50 mL三角瓶中，在30 ℃培养箱中(100 r/min)振荡培养2 h。取5 mL细胞悬浮液置于10 mL试管中，静置30 min，从凹液下准确吸取350 μL液体，于600 nm处测量吸光值(B)，试验平行3次。絮凝值flocculation value，Flo计算如公式(1)所示：

(1)

式中：Flo，絮凝值;A，在摇瓶前悬浮于絮凝缓冲液中的细胞吸光度；B，细胞絮凝沉降后的吸光度。当Flo在70%～100%时，属于低絮凝性；当Flo在30%～70%时，属于中絮凝性；当Flo在0%～30%时，属于高絮凝性。

1.2.5 本土酿酒酵母模拟发酵性能测定

将4株本土酿酒酵母和4株商用酿酒酵母用于模拟发酵试验。模拟葡萄汁中葡萄糖含量为100 g/L，果糖100 g/L，总酸3.0 g/L,酒石酸调节pH值至5.8，将其微温溶解后，过滤杀菌。在发酵结束后，参照GB/T 15038—2006测定发酵液中的总酸、还原糖、酒精度及pH。

1.2.6 发酵梅廘辄干红葡萄酒感官品评

通过发酵性能基本测定筛选出具有优良发酵性能的本土酿酒酵母与3株对照菌种分别进行发酵梅鹿辄实验，发酵结束由2位国家二级果露酒品评师、4位国家三级果露酒品评师、1位资深酿酒师组成品评团进行品评，去除1个最高分去除1个最低分，得到平均分，然后对菌种进行评价。

2 结果与分析

2.1 本土酿酒酵母菌株的嗜杀性

酿酒酵母的嗜杀性是指对外界微生物攻击具有防御能力，嗜杀性越强，代表酿酒酵母菌株对外界微生物抵御能力及抗干扰能力越强，越能更好地保障葡萄酒顺利完成发酵[12]。嗜杀酵母是指在某些酵母生长和繁殖过程中，能杀死或抑制某些毒素蛋白，无论是否与敏感菌株同源[13]。这种毒素蛋白被称为嗜杀毒素，嗜杀酵母对其自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力[14]。由图1可知，4株本土酿酒酵母与4株商业酿酒酵母的抑菌圈均具有显著的嗜杀性。商业酿酒酵母抑菌圈为5.60～7.66 mm，本土酿酒酵母抑菌圈为5.13～7.35 mm。本土筛选酵母WJ1嗜杀性显著低于商业酵母CECA，高于CEC01、XR、DS，Q12嗜杀性显著低于商业酵母XR、CECA、CEC01，与商业酵母DS较为接近且差异不显著，S1、S2其嗜杀性均高于商业酵母DS，低于商业酵母XR、CECA、CEC01且差异显著，因此4株本土筛选酵母均达到了商业酵母菌的嗜杀性，具有开发商业酵母的潜质。

图1 酵母嗜杀性抑菌圈Fig.1 Yeast killer inhibitory zone

2.2 本土酿酒酵母菌株的产硫化氢性能

硫化氢能够与铋结合生成黑色硫化铋沉淀，以铋为指示剂根据选择性培养基BIGGY颜色深度判断不同酵母菌株产硫化氢能力。接种于培养基的菌落颜色有6类，从低产到高产分别是白色、浅棕褐色、棕褐色、浅褐色、褐色和黑色。按颜色分为4个等级，其中白色菌落为不产硫化氢菌株，浅棕褐色为低产菌株，棕褐色和浅褐色为中产菌株，褐色和黑色为高产菌株[15]。由表1可知，4株商用酿酒酵母均为低产硫化氢菌株，本土酿酒酵母WJ1、Q12、S21为中产硫化氢菌株；S12为高产菌株；本土酿酒酵母产硫化氢性均高于商业酿酒酵母。硫化氢属于挥发性物质，中少量硫化氢可通过后期澄清倒罐等管理减少其在酒中含量，而高产菌株S12导致葡萄酒中其含量偏高，使葡萄酒产生不愉快的味道，例如臭鸡蛋味、大蒜味、香葱味等。因此WJ1、Q12、S21具有一定酿造学特性，S12酿造学特性不佳。

表1 本土酿酒酵母菌株的产硫化氢性能Table 1 Hydrogen sulfide production of native Saccharomyces cerevisiae strains

2.3 本土酿酒酵母菌株的产泡沫性

在葡萄酒发酵过程中，产泡沫性太强很容易导致发酵罐“冒罐”甚至爆瓶。因此在选择发酵菌株时，选择产泡沫性较低的酿酒酵母有利于发酵的进行。试管中泡沫高度分为4个等级：不产泡、低产泡(泡沫高度<2 mm)、中产泡(泡沫高度2～4 mm)和高产泡(泡沫高度>4 mm)[10]。由表2可知， 4株商业酿酒酵母均为低产泡沫性菌株，最大泡沫高度为1.12～1.60 mm，本土酿酒酵母中有3株低产泡沫菌株，最大泡沫高度在1.78～1.89 mm，其产泡沫性能与4株商业酵母菌属于同一等级，但显著高于商业菌产泡性。而本土酿酒酵母S21为中产泡沫性菌株，泡沫高度为2.15 mm。 4株本土酵母均在可接受气泡范围内，果酒酿造过程中的泡沫可通过搅拌、通入空气降低入罐量等措施进行减少或消除、来保证发酵的正常进行。

表2 本土酿酒酵母菌株的产泡沫性Table 2 Study on foaming of native Saccharomyces cerevisiae strains

2.4 本土酿酒酵母菌株的絮凝性

絮凝性是酵母黏附成团最终沉降的特性。良好的絮凝性有利于果酒的澄清及后期管理[16]。因此酵母絮凝性是果酒酿造学特性的重要指标。由表3可知，4株商业酿酒酵母的絮凝值在22.24%～28.71%，属于高絮凝菌株；本土酿酒酵母WJ1、S12絮凝值在26.34%～26.75%，絮凝值与商业酿酒酵母相似，属于高絮凝菌株；Q12、S21絮凝值在43.81%～61.55%，属于中絮凝性菌株，中絮凝菌株可通过增加澄清次数或添加澄清剂满足后期管理要求。

表3 本土酿酒酵母菌株的絮凝性Table 3 Study on flocculation of native Saccharomyces cerevisiae strains

注：表中不同小写字母表示显著(P<0.05)(下同)

2.5 模拟发酵性能检测

由表4可知，4株本土酿酒酵母的酒精度在10%vol～11%vol， 4株商业酿酒酵母酒精度10.5%vol～11%vol，S21酒精度为10%vol,显著低于其他菌株，而其他3株本土酿酒酵母与商业酿酒均差异不显著，说明3株本土酿酒酵母和商业酿酒酵母产酒精能力基本相同。

表4 本土酿酒酵母模拟葡萄汁发酵试验Table 4 Native Saccharomyces cerevisiae simulated grape juice fermentation test

本土酿酒酵母WJ1和Q12发酵液的残糖量为0.46～0.53 g/L，与商业菌株残糖量相似，S21菌株发酵液残糖含量为1.27 g/L，高于商业菌发酵液的残糖量，所有菌株发酵液残糖含量均≤4 g/L，符合葡萄酒国标干型葡萄酒的标准(GB/T15037—2006)。

WJ1和Q12发酵液中总酸含量均满足国家葡萄酒质量检测标准总酸含量规定(5～7.5 g/L)[10],和4株商业酿酒酵母总酸含量(5.03～6.68 g/L)无太大差别。S21总酸含量为11.27 g/L，说明其产酸能力显著高于对照菌种且其降酸能力较弱，总酸含量过高，在葡萄酒中如果酸性太强,会抑制葡萄酒的氧化反应及微生物的活性,酸性太强的葡萄酒会赋予葡萄酒尖酸、僵硬以及不愉快的味觉感受,对葡萄酒的品质和口感造成影响[17]。

干红葡萄酒酒精发酵持续时间一般为7～15 d[19]，4株商业酿酒酵母菌的发酵时间为14～16 d，本土酿酒酵母WJ1和Q12的发酵时间分别为14和16 d，与对照菌株相当，本土酿酒酵母S21的发酵时间为28 d。发酵时间太长酒精会抑制微生物生长，导致发酵不彻底，原料浸泡时间太长会影响葡萄酒风味[20]。结合总酸和发酵时间的影响，S21不作为优势酿酒酵母进行葡萄汁发酵试验。

2.6 菌种感官评定

如表5所示，本土酿酒酵母WJ1发酵的梅鹿辄葡萄酒品评人员平均得分78分，色泽与梅鹿辄葡萄酒色泽相近，略透明，具典型果香、酒香但略微不足，酸涩感较重，口感不够柔顺。酒体结构感一般；Q12平均得分最低为68分，颜色与典型梅鹿辄葡萄酒色泽不符，略失光泽，果香不足，回味较短，酒体寡淡，酒体欠平衡、粗糙；商业酿酒酵母中XR经品评人员评价后平均得分最高为89分，色泽呈现紫红色，有光泽，有明显的果香和花香，香气醇香浓郁，突出纯正，结构感强，优雅，余味持续时间长，典型性突出；CEC01发酵的梅鹿辄葡萄酒品评人员平均得分86分，色泽与典型梅鹿辄葡萄酒色泽相符，没有悬浮物，透明，酒体丰满，较XR酿酒酵母相比，香气略微逊色，酸涩味适中，苦味微淡，典型性明显；商业酿酒酵母CECA发酵的梅鹿辄葡萄酒平均分为73分，葡萄酒颜色较浅，浑浊，略失光，香气寡淡，回味较短，酒体不协调。

表5 本土与商用酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒感官评价 单位：分Table 5 Sensory evaluation of local and commercial Saccharomyces cerevisiae fermentation

结合感官评价结果，梅鹿辄葡萄酒的色泽、香气、口感和典型性都受到不同酿酒酵母的影响，本土酿酒酵母WJ1和Q12与对照菌株XR、CEC01、CECA发酵的梅鹿辄葡萄酒比较发现，本土酿酒酵母WJ1发酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸涩味略重，不柔和，酒体结构一般，但澄清度、色泽、香气优于商业酿酒酵母CECA发酵液。本土酿酒酵母Q12发酵梅鹿辄葡萄酒的澄清度、香气、滋味和典型性都不及商业酿酒酵母，色泽受酿酒酵母甘露糖蛋白对酚类物质的影响，发酵香是酵母菌代谢的副产物，这与酿酒酵母的发酵能力具有重要的关系，口感是香气、酸、涩、苦等滋味的综合评价结果。综上所述，本土酿酒酵母WJ1可作为商业酵母用于发酵梅鹿辄葡萄酒，而Q12有待进一步驯化。

3 结论

通过对全国多个酿酒葡萄产区酵母筛选得到的4株优良耐受性酿酒酵母均能完成果酒发酵，经过酿造学特性研究显示酵母菌S12嗜杀性达到了商业酿酒酵母菌的嗜杀性要求，且显著高于商业酵母菌DS，低产泡性，高絮凝性(Flo 26.75%)，模拟发酵残糖、酒精度、总酸、pH值均达到国标要求，但具有高产硫化氢特性，不能满足优良酵母菌酿造学特性；酵母菌S21嗜杀性达到了商业酿酒酵母菌的嗜杀性要求，显著高于商业酵母菌DS，且具有中产泡性，中絮凝性，中产硫化氢特性，模拟发酵残糖、酒精度、总酸、pH值均达到国标要求，但其发酵时间过长，不能满足优良酵母菌酿造学特性；酵母菌WJ1嗜杀性达到了商业酿酒酵母菌的嗜杀性要求，且显著高于商业酵母菌DS、XR、CEC01，且具有低产泡性，高絮凝性，中产硫化氢特性，模拟发酵残糖、酒精度、总酸、pH值均达到国标要求，能够满足优良酵母菌酿造学特性；酵母菌Q12具有明显嗜杀性，低产泡性，高絮凝性，中产硫化氢特性，模拟发酵残糖、酒精度、总酸、pH值均达到国标要求，能够满足优良酵母菌酿造学特性。经过与商业菌株的对比研究得到2株本土酵母Q12、WJ1，经过后期驯化有望为我国葡萄酒酿造提供新的本土菌种，同时为本土酿酒酵母多样性研究提供理论依据。