本土酿酒酵母发酵梅鹿辄干红动态变化研究

赵雪平，郑海武，雷蕾，李婷，张美枝*，李正英

1(内蒙古农业大学 职业技术学院，内蒙古 包头，014109) 2(内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特，010018)

我国是世界葡萄酒消费增长速度最快的国家，人均葡萄酒消费量居世界前列[1]，已逐渐成为葡萄酒生产和消费大国[2]。葡萄酒的酿造关键在于葡萄原料、工艺及发酵菌株。我国具有多个优良的酿酒葡萄产区及成熟的发酵酿造工艺，但目前葡萄酒酿造多采用进口菌株，提高了酿造成本，降低了本土葡萄酒特色。我国的酿酒葡萄产区具有多样性，葡萄种植历史同样比较悠久，为野生酵母筛选提供了宝贵的自然菌种库，挖掘本土特色酿酒酵母具有一定的研究意义。

酵母菌种对葡萄酒的品质影响很大，优良的酵母菌不仅能够保证发酵的正常完成还能够改善葡萄酒的品质[3]。葡萄酒的品质受到酸甜度的影响同时也受到酒精度、花色苷、单宁、总酚等影响。葡萄酒中的酸度一部分是由葡萄果实提供，一部分则由酵母发酵代谢产生。葡萄酒的酒精度是酵母发酵葡萄糖产生的，自身繁殖和代谢消耗葡萄糖产生酒精、甘油等物质。酚类物质在葡萄酒中扮演重要角色，酚类物质会影响葡萄酒的涩味、苦味、香气和颜色。所以准确测定葡萄酒中的总酚对评判葡萄酒品质有重要意义，同时可判断不同酿酒酵母之间总酚的差异。葡萄中主要的酚类物质为总花色苷、酚酸、单宁和黄酮类物质四大类。葡萄酒中的酚类不仅仅来自葡萄本身，还来自发酵过程中酿酒酵母的分解和老化过程中橡木的提取物。酚类化合物对葡萄酒的颜色和风味具有一定的影响。葡萄酒中单宁直接影响了葡萄酒的色泽，风味和陈酿潜力。它也是干红葡萄酒涩味的重要组成部分[4-5]。陈酿是葡萄酒中水解单宁的主要来源[6]，因此研究葡萄酒中的单宁含量十分重要。红葡萄酒颜色深度受花色苷影响很大，它是构成干红葡萄酒感官质量的重要指标之一，也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物质之一[7]。色泽直接影响人们对其品质的评价及产品的选择，挑选具有浓郁色调的葡萄酒便成为消费者购买的重要依据。葡萄果实中的花色苷主要存在于葡萄酒的果皮中。研究表明[8-9]，不同的酿酒酵母发酵干红葡萄酒中的花色苷，虽然菌种不同存在显著差异，但是各类花色苷在总花色苷的比例差别不大。但大多数新选酵母依然将其作为一个研究指标。通过测定实验组已经筛选的本土优良酿酒酵母[10]的发酵品质来判定酵母WJ1和Q12的酿酒可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源

Q12酵母菌(分离自山东平度早霞玫瑰葡萄的果实中)、WJ1酵母菌(分离自内蒙古乌海农家的发酵醪液)，由内蒙古农业大学职业技术学院内蒙古教育厅产学研科技创新平台菌种库提供；对照菌株为Excellence XR,法国诺蒙集团;CECA、CEC01，安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 实验试剂

偏重亚硫酸钾、果胶酶，意大利帝伯仕；NaOH、福林-丹尼斯试液(0.5 g/L标准溶液)、福林-酚试剂(2 mol/L标准溶液)、单宁酸、HCl、H2SO4、Na2CO3、葡萄糖、酚酞、 碘、KI、淀粉、硼酸钠、CuSO4、次甲基蓝(均为分析纯)，天津风船化学试剂科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

TARTER3100精密pH计，奥豪斯仪器有限公司;SA2202S-CW电子天平，德国赛多利斯集团;ZDJ-4A全自动电位滴定仪，上海雷磁仪器有限公司;H1全功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;100L控温发酵罐，济南中德发酵设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 梅鹿辄干红葡萄酒的发酵工艺流程及操作要点

梅鹿辄干红葡萄酒的发酵工艺流程如下：

选用成熟度良好的梅鹿辄葡萄，去除每串上的生青果粒以及发霉腐烂的果粒，除埂破碎分别加入到15个100 L的发酵罐中，入罐量为80%，加入60 mg/L的偏重亚硫酸钾，加入30 mg/L的果胶酶，冷浸渍1 d，对照组加入活化的商业酵母200 mg/L，实验组加入活化的本土酵母液1 mL/L,第1天采用开放式循环2次并压帽，以后每天采用封闭循化2次并压帽，直到发酵结束，发酵结束以发酵液比重不再发生变化为止。发酵结束放出自流汁，加入乳酸菌进行苹乳发酵，苹乳发酵结束后，冷沉降1周排除酒泥，调硫放入酒窖陈酿10个月，罐瓶得到成品干红。

1.2.2 土酵母对发酵梅鹿辄的动态影响研究

在发酵罐中依次加活化的酵母菌XR、CEC01、CECA、WJ1、Q12，并标注为CK1、CK2、CK3、A、B，实验平行测定3次。发酵过程中每天定时进行循环并在循结束测定每个发酵罐的总酸、还原糖、酒精度、丹宁、花色苷、总酚等指标，并在陈酿结束进行感官品评。

1.3 分析方法

1.3.1 总酸的测定

参照魏冬梅等[11]的方法,用自动电位滴法对发酵样品进行测定,以NaOH为滴定液,采用pH复合电极指示pH变化,根据等电点的突变判断滴定终点。

1.3.2 还原糖的测定

参照莫允焕等[12]的实验方法，用电位滴定法测定还原糖含量。

1.3.3 酒精度值的测定

样品酒精度值测定采用蒸馏法，取发酵样品100 mL，蒸馏水100 mL置于500 mL圆底烧瓶中，进行冷凝回流蒸馏，收集前100 mL蒸馏液，用酒精计和温度计分别测定蒸馏液的温度和酒精度，根据温度和酒精度参照酒精对照表查出酒精度[13]。

1.3.4 单宁含量的测定

参照李爱华等[14]的试验方法取2 mL样品放入2个100 mL容量瓶中蒸馏水定容至100 mL，然后取稀释后样品4 mL加入2 mL 蒸馏水和 12 mL 浓HCl。将配置好的样品分别等量放入2只试管(A、B)并盖塞密闭，用锡箔纸包严避光。试管A：常温下放置 30 min；试管 B：沸水浴 30 min 后冷至室温；然后2只试管分别加入1 mL无水乙醇， 酶标仪550 nm出测定试管A及B的样品波长，试管A的吸光值记为A1，试管B的吸光值记为B1。总单宁含量计算如公式(1)所示：

总单宁含量/(g·L-1)=(B1-A1)×19.33

(1)

1.3.5 总酚及花色苷的测定

参照李爱华等[14]的试验方法，通过紫外吸收法测定花色苷的含量。福林酚法测定样品中总酚含量[15]。

1.3.6 感官评价

参照GB 15037—2006葡萄酒感官要求进行评价[16]发酵结束由2位国家二级果露酒品评师、4位国家三级果露酒品评师、1位资深酿酒师、5位果酒发酵研究生，1位发酵实验员组成品评团进行品评去除一个最高分和一个最低分，得到平均分，然后对菌种进行评价。

1.3.7 数据处理

采用Excel 2007、Graphpad 6.01及SPSS 19.0进行数据分析及作图。

2 结果与分析

2.1 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酸含量的动态变化

本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酸含量的动态变化如图1所示。

图1 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酸含量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of total acid in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由图1可知，在发酵过程中总酸变化均呈先上升后下降再上升的变化趋势。本土酵母与商业对照酵母整体趋势相同，酒精发酵启动开始到发酵前6 d，由于葡萄果实压榨后浸渍和发酵过程中糖含量的减少，琥珀酸、苹果酸、乙酸含量逐渐增加[17]。发酵6 d左右总酸含量达到最大值。酒精发酵6～12 d，酸度有所下降，因为此阶段酒精发酵基本结束，12～15 d时总酸含量稍微上升，主要由于发酵结束后酒石酸氢钾在葡萄酒中过饱和存在，葡萄酒的酸稳定主要还是与酒石酸氢钾、酒石酸钙的沉淀有关[18]。总酸质量浓度一般为5～7.5 g/L[19]，发酵前梅鹿辄葡萄果汁中总酸质量浓度为4.56 g/L，发酵结束后本土酿酒酵母WJ1和Q12总酸均质量浓度分别为6.10和5.98 g/L，商业酿酒酵母总酸均质量浓度为5.93～6.00 g/L。本土酿酒酵母和商业酿酒酵母均满足发酵标准，且差异性不显著。

2.2 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中还原糖含量与酒精度的动态变化

在葡萄酒发酵过程中，酵母利用葡萄果实中的糖转化为酒精，并利用葡萄原料中糖来完成自身的生长和繁殖。因此，糖含量直接影响酵母菌的繁殖与转化功能，最终会影响葡萄酒的质量。梅鹿辄葡萄酒发酵过程中还原糖变化如图2所示。

图2 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中还原糖含量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of reducing sugar in fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

葡萄酒发酵过程中的糖含量与葡萄酒酒精度呈显著负相关性[20]，即还原糖含量越少，酒精度含量越高。梅鹿辄葡萄酒酒精度变化结果如图3所示。

图3 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中酒精度的动态变化Fig.3 Dynamic changes of alcohol in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由图2和图3可知，梅鹿辄葡萄果汁中还原糖质量浓度为204.41 g/L，在发酵0～9 d时，商业酿酒酵母和本土酿酒酵母发酵液中的还原糖含量随发酵时间的延长而降低，发酵液中的酒精度随发酵时间延长而增加。在发酵至9 d时，发酵液中的残糖含量较少为3.33～4.68 g/L，酒精度基本稳定在11.5%vol～12%vol。发酵时间为9～15 d时，发酵液中的还原糖趋于平缓，发酵液中的糖和酒精只有微量变化。经过15 d酒精发酵后，3株商业酿酒酵母发酵液中的还原糖含量为3.28～3.49 g/L，酒精度12.0%vol～12.1%vol，本土酿酒酵母WJ1的酵液中还原糖含量为3.33 g/L，显著低于对照菌CK1，但与对照菌CK2、CK3差异不显著。本土酿酒酵母Q12发酵液中还原糖含量为3.57 g/L，高于对照菌CK2、CK3，但与对照菌种CK1差异不显著，本土酿酒酵母WJ1和Q12酒精度分别为12.2%vol、12%vol，与对照商业菌株差异不显著。

2.3 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中单宁含量的动态变化

利用2株本土酿酒酵母和3株对照菌株进行梅鹿辄葡萄酒发酵，发酵过程中单宁动态变化如图4所示。

图4 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中单宁含量的动态变化Fig.4 Dynamic changes of tannin in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由图4可知，单宁含量在发酵过程中含量随发酵时间的延长而增加，是由于果实单宁含量被浸出加速单宁释放[21]。梅鹿辄果汁中单宁质量浓度62.51 g/L。酒精发酵过程中，单宁含量迅速增加，酒精发酵结束时，单宁含量达到最大，且本土酿酒酵母与商业菌株趋势相似。发酵结束后，本土酿酒酵母WJ1和Q12单宁质量浓度分别为175.14、169.24 mg/L。商业酿酒酵母单宁质量浓度在159.25～194.67 mg/L，WJ1单宁含量显著高于对照菌株CK1，显著低于CK3，与CK2差异不显著。Q12单宁含量高于CK1低于CK2、CK3，且差异显著。酵母产生的乙醛可参与形成花青素-乙醛-黄烷-3-醇衍生物，酵母发酵可加速果皮细胞壁分解作用，有利于改善葡萄酒的苦味、涩味和酒的颜色[22]。

2.4 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中花色苷含量的动态变化

花色苷主要存在于植物的细胞液中，是由花色素和葡萄糖以糖苷键结合形成的糖苷，使茎、叶、花和果实具有不同的颜色，因此对红葡萄颜色的影响较大。它也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物质之一。梅鹿辄葡萄酒发酵过程中花色苷含量变化规律如图5所示。

图5 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中花色苷含量的动态变化Fig.5 Dynamic changes of anthocyanins in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由图5可知，在0～9 d，发酵液中花色苷含量随发酵时间的延长而增加。由于葡萄皮中的花色苷类物质在发酵前期被大量浸出，花色苷大幅度增加[23]。在酒精发酵过程中，不同种类的酵母也影响葡萄酒的组成。例如，酵母释放的甘露糖蛋白加速单宁与花青素反应并增加了总花色苷含量。发酵第9天时，花色苷含量均到达最大值。WJ1Q12发酵的梅鹿辄葡萄酒中花色苷最大值分别为175.54、182.35 mg/L。商业酿酒酵母发酵液中花色苷质量浓度为174.34～184.36 mg/L，本土酿酒酵母的发酵液中花色苷含量介于商业酿酒酵母发酵液花色苷含量的范围内，且差异不显著。而酒精发酵基本结束后的9～15 d花色苷含量随发酵时间的延长而下降。因为花色苷为天然食用色素，稳定性不高，容易被氧化和分解。发酵结束后，对照菌株发酵液中花色苷质量浓度为134.35～156.30 mg/L，本土酿酒酵母WJ1、Q12发酵液中花色苷质量浓度为148.29、128.25 mg/L，WJ1发酵液中的花色苷含量高于CK1发酵液中的花色苷质量浓度，低于CK2、CK3中发酵液的含量，且差异显著，而Q12菌株发酵液中花色苷含量均低于对照菌株且差异显著。

2.5 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酚含量的动态变化

本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酚含量的动态变化如图6所示。

图6 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒过程中总酚含量的动态变化Fig.6 Dynamic changes of total phenol in the process of fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由图6可知，不同酿酒酵母发酵液中的总酚在发酵过程中均呈逐渐上升的趋势。葡萄中大量的酚类物质存在于果皮和果梗中。葡萄与葡萄酒中的总酚，是葡萄与葡萄酒中多酚类物质的总量[24]。葡萄发酵的浸渍过程使大量的多酚类物质进入葡萄酒[25]。影响葡萄颜色的主要因素是酚类物质中的花青素，单宁也是葡萄中多酚物质的主要成分。由于花色苷和单宁在动态变化中呈逐渐上升的趋势，总酚在发酵过程中也呈上升的趋势。梅鹿辄果实中总酚质量浓度916.64 mg/L。发酵结束后，本土酿酒酵母WJ1和Q12发酵液中的总酚质量浓度分别为2 070.78、2 063.12 mg/L，WJ1和Q12总酚质量浓度差异不显著，但均高于商业酵母CK1，低于商业酵母CK2、CK3，且差异显著。商业酿酒酵母发酵液中的总酚质量浓度为2 001.76～2 274.00 mg/L，本土酿酒酵母总酚含量均在商业酿酒酵母总酚含量范围内，具有较好的酿造学品质特性。

2.6 本土酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄酒的感官评价

感官评价结果如图7所示。本土酿酒酵母WJ1发酵的梅鹿辄葡萄酒13位专业人员平均得分78分，色泽与典型梅鹿辄葡萄酒色泽相近，略透明，具典型果香、酒香但略微不足，酸涩感较重，口感不够柔顺，酒体结构感一般；Q12平均得分为68分，颜色与典型梅鹿辄葡萄酒色泽不符，略失光泽，果香不足，回味较短，酒体寡淡，酒体欠平衡，粗糙；商业酿酒酵母中CK1经13位专业人员评价后平均得分最高为89分，色泽呈现紫红色，有光泽，有明显的果香和花香，香气醇香浓郁，结构感强，优雅，余味持续时间长，典型性突出；CK2发酵的梅鹿辄葡萄酒5位专业人员平均得分86分，色泽与典型梅鹿辄葡萄酒色泽相符，没有悬浮物，透明，酒体丰满，较CK1酿酒酵母相比，香气略微逊色，酸涩味适中，苦味微淡，典型性明显；商业酿酒酵母CK3发酵的梅鹿辄葡萄酒平均分为73分，葡萄酒颜色较浅，浑浊，略失光，香气寡淡，回味较短，酒体不协调。

图7 本土酿酒酵母与商业酿酒酵母发酵干红的感官评定对照Fig.7 Comparison of sensory evaluation of dry red fermented by local and commercial Saccharomyces cerevisiae注：图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)

结合感官评价结果，梅鹿辄葡萄酒的色泽、香气、口感和典型性都受到不同酿酒酵母的影响，本土酿酒酵母WJ1和Q12与对照菌株CK1、CK2、CK3发酵的梅鹿辄葡萄酒比较发现，本土酿酒酵母WJ1发酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸涩味略重，不柔和，酒体结构一般，但澄清度、色泽、香气优于商业酿酒酵母CK2发酵液。本土酿酒酵母Q12发酵梅鹿辄葡萄酒的澄清度、香气、滋味和典型性都不及商业酿酒酵母，色泽受酿酒酵母甘露糖蛋白对酚类物质的影响，发酵香是酵母菌代谢的副产物，这与酿酒酵母的发酵能力有重要的关系，口感是香气、酸、涩、苦等滋味的综合评价结果[26-27]。综上所述，本土酿酒酵母WJ1可作为商业酵母用于发酵梅鹿辄葡萄酒，而Q12有待于进一步开发。

3 结论

通过采用本土酿酒酵母与商业酿酒酵母发酵梅鹿辄干红葡萄酒并测定发酵过程及终点的总酸、残糖、酒精度、花色苷、单宁和总酚含量，及发酵结束感官评价。结果显示，在梅鹿辄葡萄酒发酵过程中，本土酿酒酵母WJ1发酵液总酸和酒精度含量略高，但与商业酵母无太大差别；Q12发酵液中还原糖含量略高于商业酿酒酵母发酵液，花色苷含量略低，其他指标与商业酿酒酵母发酵液无太大差别，本土酿酒酵母WJ1发酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸涩味略重，不柔和，酒体结构一般，但澄清度、色泽、香气优于商业酿酒酵母CECA发酵液。本土酿酒酵母Q12色泽与典型梅鹿辄葡萄酒色泽不符，略失光泽，果香不足，回味较短，酒体寡淡，酒体欠平衡，粗糙，澄清度、香气、滋味和典型性都不及商业酿酒酵母。通过与商业菌株对比研究得到的2株本土酵母Q12、WJ1，经过后期驯化有望为我国葡萄酒酿造提供新的本土菌种，同时为本土酿酒酵母多样性研究提供理论依据。