糖类和植物生长调节剂对冬虫夏草子实体人工培养的影响

陶海平，曹 莉，韩日畴*

(1.华南农业大学农学院，广州 510640；2.广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东省生物资源应用研究所，广州 510260)

冬虫夏草是青藏高原特有的名贵生物资源，由冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis侵染蝙蝠蛾Thitarodes/Hepialus幼虫形成的幼虫尸体与真菌子座复合物(丘雪红等，2016；韩日畴等，2019)。冬虫夏草含有多种活性成分，如多糖、核苷、甾醇、虫草酸等，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗菌、抗肿瘤、护肝肾等广泛药理作用，与人参、鹿茸并称“中药三大宝”(Loetal.，2013；Zhouetal.，2014；丘雪红等，2016；韩日畴等，2019)。

由于冬虫夏草菌寄主单一，蝙蝠蛾幼虫生长期长、生长环境苛刻、加上人类过度采挖，野生冬虫夏草日趋枯竭，现已被纳入濒危物种(李文佳等，2016)。为了满足人们对冬虫夏草的正当需求，保护野生冬虫夏草资源，人工培育是必由之路。于广州低海拔实验室，从四川、云南、青海分离获得的冬虫夏草菌在米饭培养基中成功培育出具有子囊孢子的冬虫夏草子实体(曹莉和韩日畴，2014；Caoetal.，2015)，这不仅为冬虫夏草菌的产业化开辟了新途径，同时直接证明了中国被毛孢Hirsurellasinensis为冬虫夏草菌真正的无性型。菌株筛选、培养基组分、温度以及诱导剂是冬虫夏草子实体生长的关键因子(韩日畴等，2019)。

冬虫夏草菌在固体和液体培养基中可观察到分生孢子、芽生孢子和菌丝。冬虫夏草菌的最佳生长温度是18～20℃，温度高于25℃时，菌丝停止生长。最适的pH范围为5～6；最佳碳源是葡萄糖，氮源是蛋白胨(王忠，2001a，b)。于液体培养基中麦芽糖比葡萄糖更有利于获得高产量的芽生孢子(Liuetal.，2019)。冬虫夏草菌液体培养参数包括接种量、温度、pH、通气等(李春如等，2004；刘欣等，2013；毛雄民等，2013；Meietal.,2013；贺宗毅等，2016；李婷婷，2017)。从新鲜冬虫夏草不同部位分离得到的菌株在固体培养基上特性不同；单子囊孢子、双子囊孢子和多子囊孢子菌株固体发酵时菌丝生长旺盛，分生孢子产量显著高于组织分离菌株(吕延华等，2016)。

不同菌株和培养基对子实体产量影响显著，如采自四川KD1202、云南的YN1202和青海的QH1208冬虫夏草菌株在人工培养基上子实体出草率分别为50%～67%、30%～35%和3%～5%(Caoetal.，2015)。在食用菌或其它真菌子实体培养过程中，经常使用安全的植物生长调节剂如吲哚乙酸、赤霉素和2,4-二氯苯氧乙酸等提高子实体的产量(张慧锋，2005；徐莉等，2008；李珍等，2016)。这些化学试剂通过调节细胞分裂、细胞增殖、细胞分化和极性，以及促进器官(如根、枝条、叶、花和果)发育发挥不同的作用，还调控植物各个生长过程，以及与病原和共生菌的相互作用(Ludwig-Müller，2015；Fricketal.，2018)。国际上已把植物生长调节剂应用作为21世纪农业实现超产的主要措施之一(朱杰丽等，2013)。

但是，目前冬虫夏草子实体人工培养的参数仍未优化。为了优化人工培养参数，本实验测定培养基中糖类和植物激素对冬虫夏草子实体产量的影响。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

冬虫夏草菌种KD1223从中国四川省康定野生冬虫夏草中采用常规方法分离、纯化获得(Caoetal.，2015)。以15%甘油贮存于-80℃冰箱中。

1.2 主要试剂

Hipure Fungal DNA Mini Kit II试剂盒购自Magen公司(中国，广州)。氯仿、异丙醇、乙醇、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸铵、维生素B1、氯化钠、酵母膏等购自广州化学试剂厂；葡萄糖、蔗糖、购自广州化学试剂厂，麦芽糖购自BioForxx GmbH，蚕蛹粉购自广东信达茧丝绸股份有限公司。十种化学试剂如6-苄氨基腺嘌呤(6-benzyl adenine，6-BA)、环磷腺苷(3′,5′-cyclic AMP)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、乙烯利(ethephon)、赤霉素(gibberellin acid，GA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)、α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，α-NAA)、三十烷醇(triacontanol)和玉米素(zeatin)购自Sigma公司。5%、15%、31%、50%的乙醇分别用于溶解α-NAA，吲哚乙酸、玉米素、吲哚丁酸、2,4-D，2%NaOH用于溶解6-BA，1%、4.8%的二甲亚砜(DMSO)分别用于溶解乙烯利、赤霉素，纯氯仿用于溶解三十烷醇。配制的试剂在超净工作台上以细菌过滤器(0.22 μM，Gelman Sciences)过滤后使用。

1.2 培养基

固体LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉16 g/L，高压蒸汽灭菌30 min。液体PPDA：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁，20 mg维生素B1，121℃高压蒸汽灭菌30 min。固体PPDA：每1 L固体PPDA培养基在液体PPDA培养基加16 g琼脂粉。PM液体培养基：每1 L水中加入200 g去皮土豆，20 g麦芽糖，10 g蛋白胨，3 g磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁，20 mg维生素B1，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

大米小麦培养基：100 mL的培养瓶中加入大米8 g、小麦8 g、蚕蛹粉0.4 g，营养液22 mL；营养液配方为每1 L营养液中糖类20 g(葡萄糖、麦芽糖或蔗糖)，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，柠檬酸铵1 g，维生素B1 20 mg；将培养基组分加入100 mL的培养瓶中，室温下浸泡1 h，然后121℃高压灭菌1 h，冷却至室温备用。

1.3 菌种鉴定

以Hipure Fungal DNA Mini Kit II试剂盒提取液体PPDA培养基中(100 rpm，9～13℃)已培养30 d的冬虫夏草菌DNA。以DNA为模板，参照冬虫夏草菌通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)、ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′)扩增核糖体DNA(ITS；ITS1-5.8S-ITS2)序列(Caoetal.，2015)，以2×Easy Taq PCR Super Mix进行PCR。反应体系(25 μL)：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，用ddH2O补充至25 μL。反应条件为94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(120 V，20 min)。将PCR产物送至上海生工生物公司测序，测序结果于NCBI中BLAST进行比对，同时构建进化树证实比对结果。

1.4 子实体培养参数测定

本论文测定的培养参数包括营养液中的糖类(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖)和植物生长调节剂。

总体培养方法如下：于超净工作台上将冬虫夏草菌培养的子实体以无菌剪刀剪碎，再以无菌镊子夹取2～3块(长约0.5 cm)加入液体PPDA培养基中，置于120 rpm摇床、9～13℃下培养60 d；以PPDA和LB平板检测所培养的菌液是否被污染；从上述培养液中取1～3 mL转接至新的液体PPDA培养基中，同样条件下培养30 d。培养30 d的菌液稀释一倍后，以每瓶12 mL量(每毫升含分生孢子3×109个，芽生孢子4.5×106个)加入上述大米小麦培养基中，将培养瓶置于9～13℃下培养60 d，当米饭小麦培养基表面菌丝全部覆盖时，将培养瓶置于4℃下诱导原基分化，根据不同参数确定不同时间收获子实体。

营养液中加入不同糖类(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖)的大米小麦培养基中接入PPDA培养基培养30 d的菌液后，9～13℃下培养60 d，然后置于4℃下分别培养第9、10、11个月后收获子实体，将收获的子实体置于烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重，记录不同处理的子实体干重和每瓶的条数。该实验每个处理设14培养瓶，3个重复，共42瓶。每次随机取样4瓶，收获子实体。

植物生长调节剂对子实体生长影响测定步骤如下：将10 μL的各种化学试剂与12 mL菌液混合，使每毫升菌液中各种化学试剂的浓度分别为1 μg、10 μg或100 μg，然后分别加入含大米小麦培养基的培养瓶中。以菌液中分别加入5%、15%、31%、50%乙醇，2%NaOH，1%、4.8%DMSO，100%氯仿作为对照。按照上述方法培养，4℃培养后8个月采收子实体。该实验每个处理设14培养瓶，3个重复，共42瓶。每次随机取样10瓶，收获子实体。

1.5 数据分析

不同处理下冬虫夏草菌子实体的干重值以SPSS软件(16.0 software，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行T检验和方差分析。以Tukey进行处理组之间多重比较。P<0.05表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 冬虫夏草菌鉴定

以ITS4、ITS5引物对冬虫夏草菌DNA进行PCR扩增，将PCR产物测序，得到的序列在NCBI数据库中进行Blast，发现与业已报道冬虫夏草菌的序列(序列号：EU570927.1)(张倢，2016)相似度达99%，同时进化树也证明实验采用菌株为冬虫夏草菌。

2.2 含糖培养基对子实体培养的影响

冬虫夏草菌在大米小麦培养基中培养2个月之后检查3种糖在培养基中菌丝的生长状况。葡萄糖培养基和蔗糖培养基中冬虫夏草菌菌丝已经覆盖培养基表面，呈灰白色；麦芽糖培养基中冬虫夏草菌菌丝生长缓慢，菌丝呈稀疏分布，处于米黄色状态。说明冬虫夏草菌在麦芽糖培养基中比在葡萄糖和蔗糖中的长得慢。

培养瓶转入4℃下7个月进行子实体第一次采收。葡萄糖培养基中冬虫夏草子实体长势最好，条数均值为每瓶8.33条，干重均值为0.4 g；麦芽糖和蔗糖培养基中均未长出子实体。

培养瓶转入4℃下9个月后，对冬虫夏草子实体进行第二次采收。葡萄糖培养基中冬虫夏草子实体已完成生长(子实体占满培养瓶，且没有白色气生菌丝，图1)，麦芽糖培养基中此时只有短小的子实体，说明葡萄糖培养基中子实体生长比麦芽糖培养基中的快至少2个月；而蔗糖培养基中仍未长出子实体且在培养瓶内出现大量的气生菌丝。

图1 培养基含葡萄糖冬虫夏草菌子实体Fig.1 Medium containing glucose Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：上图为营养液中含葡萄糖的培养基中培养9个月的冬虫夏草菌子实体。Note:The fruit body of Ophiocordyceps sinensis was cultured in glucose medium in nutrient solution for 9 months.

图2 不同糖类培养基中冬虫夏草子实体干重差异Fig.2 The dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body was different in different sugar medium注：图为冬虫夏草菌在营养液中含有葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的培养基中4℃下培养9个月后子实体干重差异。柱图中不同字母表差异显著(P<0.05,T test)。Note:Dry weights of fruiting bodies (at 4℃ after 9 months) of Ophiocordyceps sinensis from the media containing glucose (A);maltose (B);sucrose (C).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,T test).

将收获的子实体用烘箱(80℃，5 h)烘干至恒重。葡萄糖和麦芽糖培养基的子实体干重显著差异(t=3.17，df=5.148，P=0.024<0.05)(图2)。培养基中含葡萄糖时冬虫夏草子实体产量是麦芽糖的7.6倍，培养基中含蔗糖时未获得任何子实体，尽管出现大量气生菌丝。

2.3 植物生长调节剂对子实体培养的影响

加入环磷腺苷、三十烷醇和玉米素的培养瓶均未发现菌丝生长，说明这些化合物强烈抑制冬虫夏草菌的生长。加入100 μg/mL 6-苄氨基腺嘌呤的培养瓶可见菌丝生长，但未见原基分化。

加有1 μg/mL赤霉素或α-萘乙酸的培养瓶未长出菌丝，但在加入浓度为10 μg/mL、100 μg/mL时均有菌丝长出，似乎低浓度的赤霉素或α-萘乙酸对冬虫夏草菌的生长具有抑制作用。2,4-D浓度为10 μg/mL、100 μg/mL时，培养瓶中冬虫夏草菌均未长出菌丝，但加入浓度为1 μg/mL的培养瓶中菌丝生长，说明10 μg/mL和100 μg/mL的2,4-D对冬虫夏草菌生长具有明显抑制作用，但1 μg/mL浓度支持菌丝生长。

转入4℃下6个月后，收获子实体。各处理间子实体干重数据单因素方差分析，结果显示，8个不同种类和浓度的溶剂与对照均未见显著差异(df1=7，df2=112，F=0.690，P=0.681)(P>0.05)(图3)，说明不同种类和浓度的溶剂对冬虫夏草子实体的生长未产生显著影响；但是，各处理间差异显著(df1=10，df2=153，F=32.927，P=0.000)(P<0.05)(图4)。

图3 不同种类和浓度的溶剂对冬虫夏草子实体生长的影响Fig.3 Effects of different kinds and concentrations of solvents on the growth of Ophiocordyceps sinensis fruiting body注：不同种类和浓度的溶剂(2%NaOH，5%、15%、31%和50%乙醇，1%、4.8%DMSO，100%氯仿)与对照(未加入任何植物生长调节剂和溶剂)培养瓶中冬虫夏草子实体的干重。柱图中不同字母表示差异显著(P<0.05,Tukey test) 。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the culture bottles containing different solvents (2%NaOH，5%、15%、31% and 50% ethanol，1%、4.8%DMSO，100%chloroform) and from the control (without any plant growth regulators or solvents).Bars with different letters indicate significant difference (P<0.05,Tukey test).

图4 不同植物激素种类和浓度对冬虫夏草子实体干重的影响Fig.4 Effects of different plant hormone types and concentrations on the dry weight of Ophiocordyceps sinensis fruit body注：图为加入不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基中冬虫夏草子实体干重的比较。IAA，吲哚乙酸；IBA，吲哚丁酸；GA，赤霉素；ETH，乙烯利；α-NAA，α-萘乙酸；2,4-D，2,4-二氯苯氧乙酸；CK，对照(未加入任何植物生长调节剂)。1，2，3表示浓度1 μg/mL，10 μg/mL和100 μg/mL。柱图中不同字母表示差异显著(P<0.05，Tukey test)。Note:Dry weights of fruiting bodies of Ophiocordyceps sinensis from the media containing different kinds and concentrations plant growth regulators at three concentrations.IAA,indole-3-acetic acid;IBA,indole-3-butyric acid;GA,gibberellin acid;α-NAA,α-Naphthalene acetic acid;2,4-D,2,4-dichlorophenoxyacetic acid;CK,control (without any plant growth regulators).1,2,3 indicate the concentrations of 1 μg/mL,10 μg/mL or 100 μg/mL.Bars with different letters indicate significant difference (P <0.05,Tukey test).

与对照相比，加入100 μg/mL吲哚乙酸，1 μg/mL 和100 μg/mL吲哚丁酸，10 μg/mL赤霉素，1 μg/mL和10 μg/mL乙烯利，以及1 μg/mL 2,4-D的培养瓶中子实体干重均显著提高(图4)，其中加入1 μg/mL吲哚丁酸和1 μg/mL 2,4-D的培养瓶的子实体产量是对照的15倍。加入100 μg/mL赤霉素，100 μg/mL乙烯利以及10 μg/mL α-NAA-2的培养瓶子实体产量与对照的均没有显著差异。

可知吲哚乙酸在浓度范围为1～100 μg/mL时，低浓度时对子实体产量具有抑制作用，高浓度时具有促进作用。吲哚丁酸在测定浓度范围时均对冬虫夏草子实体产量具有促进作用(加入10 μg/mL的处理由于受到污染未获得数据)。当赤霉素和乙烯利浓度为10 μg/mL时子实体产量最高。α-萘乙酸在低浓度和高浓度都表现出抑制作用，中间浓度未产生抑制和促进作用。加入1 μg/mL 2,4-D对子实体产量具有强烈的促进作用，但浓度增加后产生抑制作用。

3 结论与讨论

本实验研究结果表明培养基营养液中加入不同糖类时冬虫夏草子实体干重葡萄糖>麦芽糖>蔗糖。各类糖如葡萄糖、麦芽糖和蔗糖等已广泛用于真菌或食用菌子实体的培养。不同真菌最佳糖源多样，如桑黄菌(蔗糖)(吴亚召等，2014)、白灵菇Pleurotusnebrodensis(可溶性淀粉)(李珍等，2015)、双胞蘑菇Agaricusbisporus(麦芽糖)(张倢，2016)、秀珍菇Pleurotusgeesteranus(麦芽糖)(李碧琼等，2017)、鸡枞菌Termitomycesalbuminosu(蔗糖)(李艳丽，2018)和蛹虫草Cordycepsmilitaris(蔗糖)(杨心如等，2019)。显然，这与真菌的糖代谢能力有关。本实验中，加入葡萄糖的大米小麦培养基中冬虫夏草子实体的生长速率和干重显著优于麦芽糖培养基的。在液体培养基中，麦芽糖比葡萄糖更有利于获得高产量的芽生孢子(Liuetal.，2019)。可能有利于芽生孢子生长的麦芽糖不利于大米小麦固体培养基中冬虫夏草子实体的形成。有趣的是，与许多真菌不同，蔗糖不利于冬虫夏草形成子实体，尽管在培养基中出现大量气生菌丝。诱导冬虫夏草子实体形成的糖代谢通路值得进一步研究。

在本实验结果中1 μg/mL IBA和2,4-D对冬虫夏草菌子实体生长促进效果最佳。植物生长调节剂是包括人工合成的化合物和从生物中提取的天然植物激素，用于有效调节作物生育过程，达到稳产增产、改善品质、增强作物抗逆性等目的。科学研究表明，植物生长调节剂的使用可使蔬果产量增加5%～30%(朱杰丽等，2013)。为避免食用过量，世界各国国均制定植物生长调节剂最大残留限量值规定，如欧盟规定食用菌中多效唑、氣吡脲、抗倒酯、环丙酸酰胺的最大残留限量值0.01 mg/kg，日本规定食用菌中氯苯胺灵的最大残留限量值为0.02 mg/kg；我国和美国暂未有食用菌中植物生长调节剂的限量规定(邱世婷等，2019)，尽管在果蔬上具有残留限量标准(朱杰丽等，2013)。

各种植物生长调节剂对真菌子实体的作用不同，如吲哚乙酸促进粉被虫草Cordycepspruinosa子实体生成，环磷腺苷(cAMP)增加鲜重(徐莉等，2008)；茉莉酸甲酯和吲哚乙酸能显著缩短猴头菇Hericiumerinaceus的生长周期，赤霉素、萘乙酸及吲哚乙酸能显著提高猴头菇的产量(Thuan等，2017)。本实验结果为利用安全的植物生长调节剂促进冬虫夏草子实体人工培育提供的思路。