急性心肌梗死合并心力衰竭病人血清miR-210表达与cTnI、BNP及预后的相关性

王 寅，徐颖杰，叶永刚

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)属于临床常见心血管疾病之一，AMI发病率、死亡率极高，部分病人在住院期间会并发心力衰竭(heart failure，HF)，调查显示AMI后HF的发生率达30%，死亡率达20%[1]，因此，及时诊断并控制AMI发展对于延长病人生存期、改善病人预后十分重要。以往研究显示肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)等血清生物标志物广泛用于AMI、HF临床诊断，但由于假阳性率较高，临床应用受限[2]，因此，寻找高效生物学标志物十分重要。微小RNA(micro RNA，miRNA)在心肌组织中的异常表达与各种心脏疾病的发生密切相关[3]。另外，miRNA在外周血表达非常稳定、易获取，可作为心脏疾病诊断的潜在生物标志物。本研究旨在探讨miR-210是否可以作为AMI合并HF诊断、预后的新型生物标志物，以期为AMI疾病的诊断、治疗提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年5月—2015年4月在我院治疗的92例AMI病人及85例AMI合并HF病人，纳入标准：①AMI病人经实验室诊断及冠状动脉造影检测等符合欧洲心脏病学会(ESC)颁布的第三版急性心肌梗死全球定义(2012版本)[4]；②AMI合并HF病人符合ESC颁布的第三版急性心肌梗死全球定义及急慢性心力衰竭诊疗指南[5]；③年龄18～78岁；④AMI合并HF者心功能Killip分级2～4级；⑤病人知情同意。排除标准：①川崎病、冠状动脉疾病等导致AMI；②瓣膜型心脏病、病毒心肌炎、心绞痛等导致的AMI；③既往接受过外科搭桥手术治疗；④肝肾功能严重受损；⑤脑血管、肿瘤病人。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 病人入院后记录年龄、性别，并测量心率、血压、血脂，统计发病常见危险因素如高血压、糖尿病、是否吸烟、AMI家族史等；同时采用Sonoline G50多普勒超声检测仪(德国西门子)检测左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)值。

1.2.2 血清样本收集 所有受试者入院后次日清晨空腹采集静脉血3 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内，3 000 r/min离心5 min后，收集上清置于-20 ℃保存。

1.2.3 血清cTnI检测 采用胶体金法检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测血清cTnI水平，于25 ℃下进行操作，取出检测卡放置水平位置并标记，滴加4滴待测样本，以垂直方向滴加于加样处，待T线处出现紫红色条带，采用标准比色卡对结果进行定量分析，检测范围1～50 ng/mL。

1.2.4 血清B型利钠肽(b-type natriuretic peptide，BNP)检测 采用酶联免疫法检测血清BNP水平，根据酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作：在酶标包被板设定空白孔、标准孔、待测样品孔，分别添加100 μL样品稀释液、标准品、待测样品，封膜后在37 ℃环境中孵育2 h，洗涤、甩干后，先添加100 μL显色液A，封膜后37 ℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗涤、甩干后，添加显色液100 μL B工作液，37 ℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板，每孔添加50 μL底物溶液，覆膜37 ℃避光显色20 min，添加终止液终止反应，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。绘制标准品曲线计算样品浓度。

1.2.5 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测血清miR-210表达 采用miRNA提取试剂盒(Applied Biosystems，美国)，根据说明书提取RNA，并逆转录为cDNA，采用qRT-PCR反应试剂盒(Taraka，日本)进行扩增反应，反应体系：2×miRNA SYBR Premix 10 μL，cDNA 样品1 μL，Forward及Reverse引物分别0.6 μL，补充无核酸酶水至20 μL。于PCR仪(Bio-Rad，美国)进行扩增反应，扩增程序设定：94 ℃预变性 2 min，1个循环；94 ℃变性 20 s，60 ℃退火 35 s，40个循环。每个样本设定3个重复，反应结束后，以U6作为内部参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-210相对表达量变化。

1.2.6 随访 病人均进行36个月随访，截止日期为2018年4月30日，采用复诊或电话方式进行随访，统计病人死亡人数。

1.3 诊断标准 AMI的诊断标准为：①缺血性胸痛持续时间>30 min，且服用硝酸甘油药物后不能缓解；②心电图改变：2个相邻ST段抬高>0.1 mV；③血清学标志物如心肌肌钙蛋白、肌酸激酶水平升高1倍以上；④冠状动脉造影发现冠状动脉分支存在血管病变。HF诊断标准：①病人出现呼吸困难及疲劳等典型临床表现；②肺部1/3以上部分出现湿啰音；③影像学发现肺阻塞、肺水肿；④不正常水平的脑钠肽。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 AMI合并HF组AMI病史比例、CK-MB水平均高于AMI组，LVEF低于AMI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组年龄、性别、高血压、糖尿病、心率、血压、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 AMI组与AMI合并HF组临床资料比较

注：1 mmHg=0.133 kPa。SBP为收缩压；DBP 为舒张压；LDL 为低密度脂蛋白；WBC为白细胞计数。

2.2 两组血清miR-210、cTnl、BNP水平比较 AMI合并HF组血清miR-210、cTnl、BNP水平均高于AMI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别例数miR-210cTnl(ng/mL)BNP(pg/mL)AMI组 921.05±0.340.67±0.120.63±0.12 AMI合并HF组 85 1.73±0.482.33±0.641.44±0.26t值-10.940-24.423-25.624P 0.000 0.000 0.000

2.3 miR-210与cTnl、BNP相关性分析 Pearson相关性分析显示，miR-210与cTnl呈正相关(r=0.365，P=0.000)；与BNP呈正相关(r=0.304，P=0.000)。详见图1、图2。

图1 血清miR-210与cTnl的相关性分析

图2 血清miR-210与BNP的相关性分析

2.4 影响AMI病人发生HF的多因素分析 以AMI合并HF作为因变量，将单因素分析中差异有统计学意义的AMI病史、miR-210、cTnl、BNP、LVEF、CK-MB作为自变量进行Logistic多因素回归分析，结果显示，AMI病史、miR-210、cTnl、BNP为AMI合并HF的危险因素。详见表3。

表3 AMI病人发生HF的Logistic多因素回归分析

2.5 miR-210对AMI合并HF的诊断价值 ROC分析发现，miR-210对AMI合并HF、AMI具有一定的区分能力，miR-210诊断AMI合并HF的AUC为0.850(95%CI0.813～0.914)，约登指数为0.667，临界值为1.357，诊断敏感性为77.65%，特异性为89.13%。详见图3。

图3miR-210在AMI合并HF诊断中的ROC分析

2.6 miR-210与AMI合并HF预后的关系 病人均随访3年，共死亡18例，存活率为78.82%。根据血清miR-210中位值，将病人分为miR-210高表达组、miR-210低表达组，其中miR-210高表达组39例，死亡12例，存活率为69.23%；miR-210低表达组46例，死亡6例，存活率为86.96%；miR-210低表达组存活率高于miR-210高表达组，差异有统计学意义(χ2=3.973，P=0.046)。详见图4。

图4 miR-210预后生存曲线分析图

3 讨 论

AMI合并HF是临床上常见的心脑血管疾病，其发病骤然、病情进展迅速、死亡率较高，严重威胁人类健康[6]。尽早诊断采取合适的治疗对改善AMI合并HF病人预后十分重要。临床研究表明，AMI合并HF发病早期并无临床特异表现，仅有部分病人心电图显示异常[7]。cTnI作为AMI及HF诊断常用的血清学标志物，虽诊断敏感性较高，但在其他疾病如急性或慢性肾衰竭病人中也可检测到肌钙蛋白T(cTnT)水平的升高[8]，特异度较低。因此，探寻高效的血清标志物对AMI合并HF的临床诊断具有重要价值。

miRNA为非编码RNA分子，长度为21～25 nt，通过靶向结合靶基因mRNA的3′UTR进而抑制靶基因的转录，从而降低其靶基因表达水平[9]。研究证实，miRNA的异常表达与AMI、HF等多种心血管疾病的发生有关，为发病机制中的重要调控基因[10]。一般情况下miRNA在血清中表达较稳定，容易检测，且miRNA具有组织特异性，血清miRNA的水平也具有差异。基于以上优点，血清miRNA可能成为疾病诊断及预后判定的生物学标志物。然而，关于AMI合并HF病人中外周血miRNA研究不多。

miR-210在心肌系统缺氧缺血调控中发挥重要作用。有研究显示，冠心病病人心肌长期血流供应不足，导致心肌缺氧，随着时间的延长，心肌细胞数量降低后，心功能发生障碍，导致心力衰竭[11]。在细胞缺氧缺血后，miR-210水平均升高，在多个miRNA异常表达中最显著[12]。此外还有研究证实，miR-210在缺氧后可能受到缺氧诱导因子(HIF)的诱导后水平升高，故可反映缺氧程度[13]。有研究显示，HF模型大鼠miR-451与miR-210水平均明显升高[14]。Zhao等[15]通过对比心力衰竭组、健康组、胎儿组血清miR-210水平发现，心力衰竭组血清miR-210水平显著升高，且与胎儿组比较差异无统计学意义。以上研究均提示，血清miR-210水平的异常表达与心力衰竭的发生有关，然而在AMI合并HF中的表达情况，目前尚不明确。本研究发现，与AMI组相比，AMI合并HF组血清miR-210水平显著升高，与以往研究相符，提示miR-210可能参与AMI合并HF的发生。

BNP为心室肌细胞分泌的短肽激素，研究证实AMI发生后，利钠肽系统被激活导致血清中BNP水平均显著升高[16]。多项研究证实BNP水平与HF病人病情严重程度有关，且高水平BNP预示HF病人预后不佳[17]。本研究发现AMI合并HF病人血清BNP水平明显升高，且与miR-210呈正相关，由此推测miR-210可能参与AMI合并HF的发生发展过程。HF发生后，心肌细胞通透性增强，细胞质内游离cTnI进入血液中，导致其水平升高，且其水平的持续升高会破坏心肌细胞结构，因此，cTnI水平可反映心肌损伤及病情程度[18]。本研究发现AMI合并HF病人血清cTnI水平明显升高，且与miR-210呈正相关，由此推测miR-210可能与AMI合并HF病情有关。

为进一步明确miR-210与AMI合并HF发生的关系，本研究采用Logistic多因素回归分析，发现miR-210为AMI合并HF发生的独立危险因素。基于miR-210在AMI病人、AMI合并HF病人中的表达差异，可能成为AMI合并HF发生的预测靶点，可能对AMI合并HF具有潜在的诊断价值。本研究采用ROC曲线分析显示，miR-210诊断AMI合并HF的AUC值为0.850(95%CI0.813～0.914)，约登指数为0.667，临界值为1.357，诊断敏感性为77.65%，特异性为89.13%，提示血清miR-210对AMI合并HF具有一定的预测价值。

越来越多的研究显示，miRNA可对心脏疾病预后进行评估。血浆hsa-miR-30a升高是高血压左室肥厚病人预后不良的独立预测因子[19]。AMI病人血清miR-1水平较低者术后恢复较好。符雅菁等[20]研究显示，AMI病人血清中miR-214水平与冠状动脉狭窄范围及预后有关。本研究经过KM生存曲线分析发现miR-210高表达者3年生存率低于低表达者，提示miR-210高表达者病情严重，预后不佳。

综上所述，血清miR-210水平在AMI合并HF病人中升高，与BNP、cTnI相关，且为AMI合并HF发生的独立危险因素，与病人不良预后有关。但是，由于AMI合并HF发生机制较复杂，本研究仅从临床角度探究其表达意义，而关于分子机制缺乏相关研究，因此，仍然需要继续深入的研究，为AMI合并HF的预防和治疗提供新的依据。