蒙古栎橡实蛋白的提取工艺研究

金 山，王月婵

（1.新宾满族自治县自然资源发展中心，辽宁 抚顺113200；2.辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳110032）

橡实是栎树果实的统称。我国栎树品种较多，根据地区划分为北栎和南栎。北栎主要包括辽东栎和蒙古栎，南栎主要为高山栎、青冈栎和柞栎等品种。蒙古栎在北方种植面积广，全国达100万hm2，其生存能力及繁殖能力强，蒙古栎橡实的产量颇高。蒙古栎橡实的营养价值较高，是有待精深开发的重要经济植物资源。蒙古栎橡实的主要成分是淀粉和蛋白质，其中蛋白质含量达15%。近年，蒙古栎橡实营养成分的开发逐渐受到重视，已有报道利用橡实加工淀粉，生产动物饲料及开发橡实酱等食品。然而橡实中高含量的蛋白并未得到充分的开发利用。由于橡实在我国属于半野生植物资源，国内对橡实中营养成分的研究还不充分，造成橡实资源的严重浪费。因此，本研究利用酶解法对橡实蛋白进行提取，结合单因素及正交试验方法进行分析，对蒙古栎橡实蛋白的提取工艺进行研究，为提高蒙古栎橡实的经济价值，开发功能性蛋白食品提供科学依据［1］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为蒙古栎橡实，于2018年10月5日采自吉林省吉林市经济开发区吉祥路韩丰食品有限公司。置于常温瓦楞纸壳箱子转运至实验室，放置于通风阴凉处备用。

将蒙古栎橡实脱脂制成橡实粕，备用；木瓜蛋白酶（50 万U·g-1），中性蛋白酶（6 000 U·g-1），碱性蛋白酶（10 万U·g-1），牛血清白蛋白（Bio Basic 公司，纯度98%）等均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：大连格莱瑞机械有限责任公司；TU-1810 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；CR21G 冷冻离心机：日立有限公司；85-2恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司等。

1.3 方 法

1.3.1 蒙古栎橡实蛋白提取流程

称取一定质量橡实，脱皮后干燥粉碎，用7倍体积正己烷对橡实粉进行脱脂处理，将橡实粉过40目筛，得脱脂橡实干粉。称取一定质量脱脂橡实粉，按一定比例添加磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=7），调节pH 值及温度后，以4 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，然后调节pH 值至等电点沉淀蛋白，干燥，得橡实水解蛋白。

1.3.2 蒙古栎橡实蛋白提取率测定方法

采用Folin-酚法测定上清液中蛋白质含量，原料蛋白质含量用凯氏定氮法测定［2-3］。

橡实粕水解蛋白提取率=（上清液蛋白质含量/原料蛋白质含量）×100%

1.3.3 蒙古栎橡实蛋白提取酶的比较

准确称取脱脂橡实粕冻干粉5 g，按照1︰5 的料液比将橡实粕冻干粉配置成水解液，向水解液中添加1%的木瓜蛋白酶，将其pH 值调节到6.0，转移到60 ℃下水解2.5 h 后加热到90 ℃，灭活木瓜蛋白酶15 min，转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。

准确称取脱脂橡实粕冻干粉5 g，按照1︰5 的料液比将橡实粕冻干粉配置成水解液，向水解液中添加1%中性蛋白酶，将其pH 值调节到7.0，转移到40 ℃下水解2.5 h 后加热到90 ℃，灭活中性蛋白酶15 min，转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。

准确称取脱脂橡实粕冻干粉5 g，按照1︰5 的料液比将橡实粕冻干粉配置成水解液，向水解液中添加1%碱性蛋白酶，将其pH 值调节到10.0，转移到45 ℃下水解2.5 h 后加热到90 ℃，灭活碱性蛋白酶15 min，转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。

1.3.4 单因素试验

准确称取橡实粕冻干粉5 g，以蛋白提取率为考察指标，以加酶量、pH 值、温度及时间为考察对象，分析4种不同因素对蛋白提取率的影响。单因素试验水平如表1。

表1 单因素试验水平表

1.3.5 正交试验

以单因素试验结果为考察依据，以加酶量、pH值、温度及时间为考察因素，以蛋白提取率为参考指标，设置酶添加量1.2%、1.4%、1.6%；pH 值为10.5、11、11.5；酶解时间2.5 h、3.0 h、3.5 h；酶解温度45 ℃、50 ℃、55 ℃，以正交试验L9（34）为基础进行4因素3水平试验（表2）。

表2 正交试验水平表

1.4 数据处理

试验数据使用Origin 7.5统计软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 蒙古栎橡实蛋白提取酶的比较

由表3可知，3种蛋白酶酶解橡实蛋白提取率由高到低分别为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。碱性蛋白酶的蛋白酶解率最高达42.3%，因此选择碱性蛋白酶为蛋白酶解工艺研究的水解酶。

表3 蒙古栎橡实蛋白提取酶的比较

2.2 单因素试验

2.2.1 加酶量对橡实粕蛋白酶提取率的影响

分别向橡实粕水解液中加入0.2%、0.6%、1.0%、1.4%和1.8%的碱性蛋白酶，将其pH值调节到10.0，转移到45 ℃下水解2.5 h 后加热到90 ℃，灭活碱性蛋白酶15 min。转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。如图1 所示，随碱性蛋白酶含量的升高，蛋白提取率呈先升高后平缓变化的趋势，当加酶量为1.4%时，蛋白提取率达45.1%。当加酶量继续升高至1.8%时并没有显著变化。结合实际情况并节约资源，选择1.4%为碱性蛋白酶的最适添加量。

图1 加酶量对橡实粕蛋白酶提取率的影响

2.2.2 pH值对橡实粕蛋白酶提取率的影响

向橡实粕水解液中加入1.4%的碱性蛋白酶，将其pH 值调节到8.0、9.0、10.0、11.0 和12.0，转移到45 ℃下水解2.5 h 后加热到90 ℃，灭活碱性蛋白酶15 min。转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。如图2 所示，随pH 值的升高，蛋白提取率呈先升高后平缓变化的趋势，在pH 值为11时达到最高，蛋白提取率达47.1%。因此，选择最适pH值为11。

图2 pH值对橡实粕蛋白酶提取率的影响

2.2.3 时间对橡实粕蛋白酶提取率的影响

向橡实粕水解液中加入1.4%的碱性蛋白酶，将其pH 值调节到10.0，转移到45 ℃下水解1 h、2 h、3 h、4 h和5 h后加热到90 ℃，灭活碱性蛋白酶15 min。转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。如图3所示，酶解3 h时蛋白提取率达到最高48.2%。当时间继续延长时蛋白提取率变化不明显。因此，选择3 h为最适酶解时间。

2.2.4 温度对橡实粕蛋白酶提取率的影响

向橡实粕水解液中加入1.4%的碱性蛋白酶，将其pH 值调节到10.0 转移到30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下水解3 h 后加热到90 ℃，灭活碱性蛋白酶15 min。转移至室温冷却后，离心取上清液冻干测定蛋白提取率。如图4 所示，温度为50 ℃时蛋白提取率达到最高50.1%。因此，选择50 ℃为最适酶解温度。

图3 时间对橡实粕蛋白酶提取率的影响

图4 温度对橡实粕蛋白酶提取率的影响

2.3 正交试验

由表4 可知，对橡实粕蛋白提取率影响由高到低的因素分别是酶添加量、酶解温度、pH 值和酶解时间，最优提取条件为酶添加量1.4%，pH值11.5，酶解温度50 ℃，酶解时间2.5 h。在此条件下进行验证试验，3组平行实验的提取率均值为56.13%。

表4 正交试验结果

续表4 正交试验结果

3 结 论

本研究通过酶解法对橡实蛋白提取工艺进行研究，首先通过比较木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解效果选取适宜的水解酶。选取碱性蛋白酶为水解酶进行单因素试验，以加酶量、pH值、温度及时间为考察对象，分析4种不同因素对蛋白提取率的影响，确定酶添加量为1.4%，pH 值为11，酶解温度50 ℃，时间3 h 时为适宜的提取条件。以单因素实验的研究结果为依据，进行正交试验分析，得到最佳提取工艺：酶添加量为1.4%，pH 值为11.5，酶解温度50 ℃，时间2.5 h，蛋白提取率达54.6%。在此条件下进行验证试验，3组平行实验的提取率均值为56.13%，说明该方法所得结论符合实际，提取条件适宜。