高效液相色谱-串联质谱法同时测定精油类化妆品中31 种生物碱

吕小会，罗辉泰，黄晓兰*，吴惠勤，霍延平，张秋炎，朱志鑫

(1.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广东省测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室,广东 广州 510070)

精油最早起源于古埃及，是贵族生活中的奢侈品。而随着社会的进步，生活水平的提高，消费观念的转变，具有天然生物活性的植物精油成为人们日常生活中不可缺少的护肤品[1]。植物精油具有抗氧化、清除自由基、抑制真皮层基质降解酶活性的作用，从而可以更新改善真皮层基质的组成和结构，达到保健美容功能[2]。这些功能的实现是由于植物精油中的活性分子小、易渗透，可以迅速地通过表层皮肤渗透进入皮肤底层，促进皮肤的血液循环，起到调理皮肤、美肤的作用，因此精油具有“液体黄金”的美誉[3]，精油类化妆品的热度也逐年增加。

植物精油提取自植物的花、叶、茎、根或果实，主要通过水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、超临界萃取法和亚临界水提取法[4]定向获取和浓缩植物中的多种有效成分。天然植物中，除了有利于人体的生物活性因子外，还有一些不利于人体的物质，例如分布极其广泛的植物次生代谢产物生物碱[5]。植物精油的沸点大部分为150～300 ℃，因此在精油提取过程中会导致天然植物中部分生物碱存在残留。由于部分生物碱具有很强的生物活性和一定的毒性，例如微量的钩吻碱、乌头碱会致命，秋水仙碱可诱导染色体变异，雷公藤成为半个世纪以来发生中毒最多的中药之一，其毒性成分中生物碱含量位居第2位[6]，因此精油类化妆品的安全性日益成为广大消费者关注的问题。在欧盟化妆品规程[7]及中国2015版《化妆品安全技术规范》[8]中均明确将部分有毒生物碱列为化妆品组分中的禁用物质，2019年7月实施的最新国家标准方法[9]也颁布了化妆品中10 种生物碱的检测方法，因此精油类化妆品中生物碱的检测和监控应受到重视。

目前，国内外关于生物碱检测研究的文献较多，主要有高效液相色谱法(HPLC)[10]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[11-12]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[13-17]，其中HPLC-MS/MS法较为常见，主要由于大部分生物碱为较难挥发的物质，不适用于GC-MS法检测。已有文献对生物碱的研究主要集中于体液、食品、药材等方面，而关于化妆品中生物碱检测方法的文献报道不多。其中，文献[18-21]采用HPLC-MS/MS法测定了化妆品中的生物碱，但测定种类较少，且所涉及的化妆品基质为水剂和乳液膏霜类等，精油类化妆品中生物碱的检测方法未见报道。另一方面，随着化妆品由单一检测指标朝着多元检测指标发展，化妆品中需检测的物质通常包括同一类物质中的多种化合物[22]。因此，本文针对化妆品中的植物精油基质，研究多种生物碱的高通量检测方法，建立了HPLC-MS/MS同时测定精油类化妆品中31 种生物碱的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1200SL Series RRLC-6410B Triple Quard MS 液相色谱-串联四极杆质谱仪(美国Agilent公司)；KQ3200型台式机械超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；XW-80A快速混匀器(海门市麒麟医用仪器厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司)，甲酸( LC-MS级，美国Sigma公司)；实验用水为二次蒸馏水。

标准品：雷公藤次碱、雷公藤吉碱、黄华碱、钩吻素子、秋水仙碱、山梗菜碱购于上海同田生物科技有限公司，东莨菪碱、麻黄碱、倒千里光碱、麦角新碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱购于天津一方科技有限公司，阿托品、氧化苦参碱、钩吻素甲、那可丁、吴茱萸碱、芦竹碱和哈尔碱购于阿拉丁试剂公司，青藤碱和毒扁豆碱购于Sigma公司，山莨菪碱、士的宁、马钱子碱、延胡索乙素、毛果芸香碱、西伐丁、苯甲酰次乌头原碱和高三尖杉酯碱购于中国药品生物制品检定所。以上标准品的纯度均大于98%。

样品：客户送检的植物精油类化妆品，取样前混合均匀。

1.2 标准溶液的配制

准确称量适量31 种生物碱标准品，用甲醇分别溶解，配制成质量浓度为100 mg/L的单标准储备液，置于棕色瓶中于-20 ℃保存。根据需要，吸取各单标准储备液适量，用20%甲醇稀释并配制成10 mg/L的混合标准工作溶液，置于棕色瓶中于4 ℃保存。吸取适量10 mg/L混合标准工作溶液用甲醇-水(3∶1，体积比)稀释成2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列混合标准工作溶液。同时吸取适量的10 mg/L混合标准工作溶液用阴性空白基质提取液稀释定容，得到质量浓度为2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列基质匹配工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称取均匀试样1.0 g(精确至0.01 g)于25 mL具塞比色管中，用含有2%甲酸的甲醇-水(3∶1)定容至10 mL，在快速混匀器上充分涡旋混匀1 min，超声提取10 min，再加入1 mL正己烷，涡旋5 min，4 000 r/min离心10 min，弃去正己烷层，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS分析。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件HPH-C18色谱柱(2.7 μm，100 mm×2.1 mm)；柱温：35 ℃；流动相A：0.2%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.35 mL/min；进样量：5 μL。梯度洗脱程序：0～3 min，96%～92% A；3～5 min，92%～90% A；5～8 min，90%～88% A；8～10 min，88%～81% A；10～13 min，81%～75% A；13～15 min，75%～55% A；15～16 min，55%～35% A；16～17 min，35%～96% A。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；采集方式：多反应监测(MRM)；雾化气压力：276 kPa；干燥气流速：8 L/min；干燥气温度：300 ℃；毛细管电压：4 000 V。31种生物碱的保留时间、母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能量见表1。

表1 31种生物碱的CAS号、保留时间及质谱参数Table 1 CAS numbers，retention times and MS parameters of 31 alkaloids

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

由于生物碱的分子结构中含有N原子，N原子上的孤电子对易与质子结合，因此本实验采用正离子模式(ESI+)，在一级质谱全扫描模式下采集正离子信号，结果发现31种生物碱的特征母离子均为[M+H]+。再以分子离子为母离子进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，选取丰度较强且干扰较小的2个子离子分别作为定量离子和定性离子，再对得到的二级质谱参数进行优化，使定量离子和定性离子的响应最大，最终得到31种生物碱的最佳质谱参数，结果见表1。

2.2 色谱条件的优化

良好的色谱分离是定性定量分析的前提和关键，根据前期分离生物碱的经验，分别选择填料为内嵌极性基团键合相的反相色谱柱Bonus-RP(3.0 μm,100 mm×2.7 mm)和填料为表面多孔层的反相色谱柱HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)进行分离。结果显示，采用Bonus-RP(3.0 μm,100 mm×2.7 mm)时，山梗菜碱、山莨菪碱的峰形差，总离子流图中出现了较多包峰，分离度较差；采用HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)色谱柱时，黄华碱、毛果芸香碱和氧化苦参碱的出峰时间较早，可能是由于HPH-C18的填料对吡啶烷类生物碱的键合能力较弱，从而导致保留较弱，但整体上可得到很好的峰形，分离度亦有明显改善，因此选择HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)色谱柱。

流动相的选择对目标物的分离、灵敏度以及峰形有很大影响，实验发现以乙腈为有机相时31种目标化合物的峰形较好。此外，由于生物碱均含有N原子，其N原子上的孤电子对能接受质子而对pH值较敏感，在pH较低时生物碱会以结合状态存在，所以在水相中加入适量甲酸有助于[M+H]+的形成，提高响应，并改善峰形[23]。实验结果表明，以0.2%甲酸水溶液-乙腈为流动相时最为理想。最后进一步优化梯度洗脱程序，使目标化合物获得良好的分离，且保留时间分布相对均匀。 31种生物碱的定量离子对色谱图见图1。

图1 31种生物碱的分子结构和定量离子对的MRM色谱图Fig.1 Molecular structures and quantitative ion pair MRM chromatograms of 31 alkaloids the order is the same as that in Table 1

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的优化实验比较了以甲醇或乙腈为提取溶剂时的响应，发现甲醇比乙腈提取后的响应高，因此选择甲醇为提取溶剂。当提取液中有机相为100%时，极性强的生物碱色谱峰出现前延现象，且峰形差，因此考察了甲醇与水在不同比例下的回收率和色谱峰形，结果显示甲醇与水的体积比为3∶1时，31种生物碱的离子峰强度较好，同时峰形也较理想。由于生物碱大多数为弱碱性化合物，在提取溶剂中加入酸易形成生物碱盐，可增加生物碱的水溶性，而多数生物碱盐可溶于甲醇中。因此比较了在提取溶剂中加入不同含量甲酸对31种生物碱提取效果的影响，发现加入甲酸的含量为2%时，各生物碱的回收率较高，最终确定以含2%甲酸的甲醇-水(3∶1，体积比)为提取剂。

2.3.2 净化条件的优化精油中含有较多油脂类物质，因此样品前处理的关键是去除油脂，同时样品净化程度高，有利于对色谱柱和仪器的保护。EMR-Lipid固相萃取小柱具有选择性吸附复杂基质中脂质的作用，同时也具有高效的净化能力；正己烷是一种传统的除脂溶剂。因此分别考察了正己烷和EMR-Lipid小柱对油脂的去除效果，结果显示，与正己烷除脂相比，EMR-Lipid小柱在降低基质效应方面无明显优势。这是由于EMR-Lipid小柱主要对含5 个以上碳链的脂肪类物质的去除效果较好，而精油中一般不含有较长链的脂肪类物质，因此本实验采用正己烷除脂，操作更为简便且节约成本。

2.4 基质效应的评价

质谱分析尤其是电喷雾质谱分析往往存在基质效应(Matrix effect，ME)，从而影响分析方法的灵敏度、精密度和准确度[24]。将“1.2”配制的系列混合标准工作溶液上机测定，以定量离子峰面积为纵坐标(y)，对照品溶液的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，绘制标准工作曲线。本实验采用基质标准曲线拟合的线性方程斜率与溶剂标准曲线线性方程斜率的比值(Slope ratio,SR)[25-26]评价基质效应。若SR=100%，说明无基质效应；若SR为80%～120%，说明存在基质效应，但影响不大；当50%150%，表示基质效应强烈[27]。由表2可知，13%的生物碱在精油中的基质效应不大，52%的生物碱属于中等程度的基质效应，16%的生物碱接近于中等程度的基质效应，19%的生物碱属于强烈的基质效应，其中有雷公藤次碱、苯甲酰次乌头原碱、雷公藤吉碱、氧化苦参碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱。目前，基质效应可在前处理或仪器分析时消除[28]。在仪器分析时消除基质影响一般采用基质匹配标准溶液作校准曲线或通过内标法进行校正。因此,本实验采用基质匹配标准溶液作校准曲线以消除基质效应的影响。

表2 31种生物碱的线性方程、相关系数、基质效应、线性范围、检出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects,linear ranges，LODs and LOQs of 31 alkaloids

2.5 线性关系、检出限与定量下限

在最优的色谱-质谱条件下，对质量浓度为2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列混合标准工作溶液进行测定。以各待测物的定量离子对峰面积为纵坐标(y)、对应的质量浓度为横坐标(x，μg/L)绘制标准曲线，结果显示31 种生物碱在各自的质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数为0.992 8～1.000 0(见表2)。通过测定质量浓度为2.5 μg/L的基质混合标准工作溶液，计算得到各化合物的检出限(LOD，S/N=3)为0.09～3.03 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)为0.31～10.12 μg/kg，结果见表2。

2.6 回收率与相对标准偏差

取阴性精油化妆品，进行3个浓度水平(LOQ、2LOQ、10LOQ)的加标回收实验，每个水平平行测定6次，计算各待测物的平均回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，3 种加标浓度的平均回收率为63.3%～126%，RSD为0.73%～17%(见表3)，方法的回收率和精密度均能满足日常检测的要求。

表3 31种生物碱在精油化妆品基质中的加标回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations for 31 alkaloids in essential oil cosmetics

2.7 实际样品的检测

按照本方法对20 个精油类化妆品进行检测，均未检出待测31 种生物碱。选取其中代表性的10 个样品，加入20 μg/L的31 种生物碱混合标准溶液，按照本方法进行提取并测定，得到加标回收率为69.1%～112%，符合质控要求。

3 结 论

本研究建立了HPLC-MS/MS同时测定精油类化妆品中31 种生物碱的分析方法，样品以含有2%甲酸的甲醇-水(3∶1)作为提取剂，正己烷除脂，通过HPH-C18色谱柱实现了31 种组分的分离。该方法样品前处理简便、高效、经济，色谱分离效果好，检出限为0.09～3.03 μg/kg，同时方法的回收率和精密度均能满足日常化妆品中生物碱的检测要求。