猪弓形虫实时荧光PCR 检测方法的建立与应用

（河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008）

弓形虫病（toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种专性细胞内寄生性原虫病，呈世界性流行[1]。该虫可感染人以及几乎所有的温血动物[2]，被弓形虫感染的肉或未熟制的肉、奶等动物性产品也会传播该病，因而极大影响公共卫生安全。据统计，欧洲猪弓形虫感染率可达64%[3]。正常人感染后一般呈隐性带虫状态，虫体在宿主体内以包囊形式存在[4-5]。近年来，PCR技术在人及实验动物弓形虫病诊断中已有报道[6-8]，也有将PCR 技术用于猪弓形虫病诊断的研究[9-10]。猪感染弓形虫后往往会体温升高，食欲减退，呼吸困难，甚至死亡，怀孕母猪会发生流产[11]。因此，利用简单、快速、准确的检测方法，尽早对猪弓形虫病作出准确诊断，对控制弓形虫病至关重要。实时荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）是一种新型诊断工具，具有敏感、快速、准确的优点，并且在核酸快速扩增的同时，可实现模板的定量测定[12-13]。本研究通过设计比较不同引物探针，建立了猪弓形虫实时荧光定量PCR 检测方法，以期为猪弓形虫病的诊断提供快速、敏感、特异的临床检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒（菌）株、临床样本

猪弓形虫感染病料，由河南省动物疫病预防控制中心保存；灭活的2 型猪链球菌、2 型副猪嗜血杆菌，附红细胞体、猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2 型等，均由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存并提供；猪弓形虫临床样品，为河南省动物疫病预防控制中心实验室采集河南各地市猪场样品。

1.2 仪器设备与主要试剂

KingFisher 全自动核酸提取仪，购自美国Thermo Fisher 公司；DNA/RNA 磁珠提取试剂盒，购自Abmion 公司；ABI 7500 荧光定量PCR 仪，购自美国ABI 公司；ExTaqDNA 聚合酶、Rnase Inhibitor、DL 2 000 bp DNA Marker、DNA 回收试剂盒、质粒DNA 小量纯化试剂盒等，购自宝生物工程（大连）有限公司；M-MLV 反转录酶、pGEM-T easy 载体，均购自Promega 公司。

1.3 引物设计和合成

通过大量比对GenBank 中弓形虫基因序列，选取高度保守且具有型特异性的基因序列为模板，设计弓形虫特异性引物对和TaqMan MGB 探针。上游引物序列P1：CTGTGCACCCCCGGATAC；下游引物序列P2：TCCTGCGCTGCTTCCAAT；探针序列Probe-P3：FAM-TGCACTGGCTTCCA 。由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 模板制备

以猪弓形虫阳性样品为阳性对照，水为阴性对照，采用磁珠法提取核酸，-20 ℃保存或直接用于后续PCR 扩增。

1.5 猪弓形虫标准品制备

采用本实验室建立的猪弓形虫PCR 检测方法[10]扩增猪弓形虫基因片段，将弓形虫阳性扩增产物克隆入pGEM-T Easy 载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司，采用T7 和SP6 引物进行测序。对测序正确的猪弓形虫重组阳性质粒，应用分光光度计测定其OD260、OD280及OD260/OD280值，共重复5 次；参考Kim 等[14]介绍的方法计算其浓度。

1.6 FQ-PCR 反应条件优化

将猪弓形虫制备的DNA 稀释至终浓度1.0×105拷贝/μL 作为检测模板，P1/P2 引物对和Probe-P3 探针分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和1.0 µmol/L；应用荧光定量PCR 仪，采用矩阵法筛选不同浓度的弓形虫引物和探针组合；对PCR 反应温度、反应时间、PCR 各循环数进行优化，获得最低Ct 值和较高的荧光强度。

1.7 敏感性试验

将获得的猪弓形虫DNA 分别作10 倍系列稀释，将DNA 终浓度依次调整为1.0×106～1.0×100拷贝/μL，共7 个稀释度，以水为阴性对照，按已优化的FQ-PCR 反应条件进行猪弓形虫FQ-PCR 敏感性试验。

1.8 特异性试验

对猪链球菌2 型、副猪嗜血杆菌2 型、附红细胞体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2 型等提取核酸，同时将浓度为1.0×105拷贝/μL 的阳性重组质粒混合物作为阳性对照，水为阴性对照，按优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，验证该方法的特异性。

1.9 稳定性和重复性试验

分别将4 个浓度的10 倍系列稀释的猪弓形虫DNA（终浓度1.0×104～1.0×101）进行FQ-PCR 扩增，每个系列设定3 个重复，验证该方法的稳定性和重复性。

1.10 应用试验

将建立的猪弓形虫FQ-PCR 方法与猪弓形虫普通PCR 检测方法进行比较。配制检测试剂，以阳性质粒为阳性对照，水为阴性对照，对60 份临床疑似猪弓形虫感染全血及肺脏样品进行检测。首先对60 份样品、阴阳性对照用匀浆机研磨匀浆，5 000 r/min 离心5 min，取上清100 µL，用核酸提取仪提取核酸；利用建立的方法和猪弓形虫PCR检测试剂及其检测方法，对每个样品和阴、阳性对照进行实验室检测；最后，比较分析这两种方法的检测结果，并与测序结果比较。

2 结果与分析

2.1 标准品制备

结果（图1）显示，重组质粒的扩增产物大小为272 bp，计算出的重组阳性质粒DNA 浓度为9.22×1010拷贝/μL。

图1 猪弓形虫PCR 扩增结果

2.2 反应条件优化

优化的25 μL PCR 反应体系中，猪弓形虫P1/P2 终浓度均为0.4 μmol/L，Probe-P3 终浓度为0.6 μmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5 μL，5U/μL ExTaqDNA 酶0.25 μL，1.0×105拷贝/μL 的cDNA 模板各2 μL，补足去离子水至终体积25 μL。优化的PCR反应程序为：94 ℃，5 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，40 个循环。

图2 猪弓形虫FQ-PCR 的扩增曲线

2.3 敏感性试验

结果（图3）显示，FQ-PCR 检测猪弓形虫的最低检出限为1.0×101拷贝/μL，101～107拷贝/μL模板范围内的扩增曲线有很好的线性关系。

图3 敏感性试验结果

2.4 特异性试验

结果（图4）显示，猪弓形虫的检测Ct 值为16.513 2，且出现特定的扩增曲线；但猪链球菌、副猪嗜血杆菌、附红细胞体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均未出现特定的扩增曲线。

图4 特异性试验结果

2.5 稳定性和重复性试验

3 个浓度分别为1.0×104、1.0×103、1.0×102拷贝/µL 的猪弓形虫DNA 3 次试验结果均为阳性，浓度为1.0 拷贝/µL 的猪弓形虫DNA 3 次试验结果均为阴性，说明建立的弓形虫FQ-PCR 方法具有很好的稳定性和重复性。检测结果见表1。

表1 FQ-PCR 稳定性检测结果

2.6 应用试验

采用建立的猪弓形虫实时荧光PCR 方法，检测60 份临床疑似猪弓形虫感染全血及肺脏样品，结果32 份样品为猪弓形虫核酸阳性；采用普通RT-PCR 检测，结果29 份样品为猪弓形虫核酸阳性。应用试验结果表明，建立的猪弓形虫实时荧光PCR 方法比普通PCR 方法的灵敏性高。该FQPCR 方法检测结果与猪弓形虫基因测序结果符合率为100%，说明建立的猪弓形虫实时荧光PCR 方法检测结果准确。

3 讨论

MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB 修饰基团，可以将探针的Tm 值提高10 ℃左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，从而既降低了合成成本，也使得探针设计成功率大为提高；而且TaqMan-MGB 探针特异性好，敏感性更高。所以，本研究采用了TaqMan-MGB 探针，以达到更加特异、敏感的猪弓形虫检测效果。

猪弓形虫特异PCR 诊断的遗传标记主要有B1基因、ITS序列、529 bp 重复序列、致密颗粒蛋白、SAG1基因等。SAG1是弓形虫的主要表面抗原基因，表达的蛋白约占虫体蛋白总量的3%～5%，能被弓形虫感染急性期或恢复期血清抗体识别，是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原。本实验室在2007年就建立了以猪弓形虫核糖体DNA 第一内转录间隔区（ITS1）序列为模板设计引物，建立了猪弓形虫病特异PCR 诊断方法[10]。该法可从基因组DNA中扩增出272 bp 的目的片段，特异性好、敏感性高，最低能检测到的弓形虫DNA 量为0.001 ng，且与相关的9 种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。本实验室在此基础上根据弓形虫ITS1基因设计TaqMan-MGB 引物和探针，建立了诊断弓形虫病特异性的FQ-PCR 方法。试验结果显示：该法最低能检测到10 拷贝/µL 的猪弓形虫DNA，且与寄生于猪体内的7 种常见微生物无交叉反应；该检测方法相比普通PCR 检测方法，即提高了敏感性，又节约了时间，而且能够对核酸片段进行相对定量。

临床上猪弓形虫常与其他病原，如猪附红细胞体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2 型、猪链球菌2 型等发生混合感染。这些病原感染引起的临床症状类似，而且混合感染后引起的病死率大大增加，因此需要借助实验室诊断才可以鉴别。此外，许多猪群感染猪弓形虫后可以不表现明显临床症状而处于潜伏感染状态，但一旦外界环境改变或患其他疾病或机体抵抗力降低，则会引起疫病发生。因此，建立弓形虫病原检测方法，对于该病的早期诊断、检测、防治及猪群净化非常必要。弓形虫病原学涂片检测仅适合于弓形虫病急性暴发性病例的死后诊断，而对慢性感染或经药物治疗后的病例意义不大，容易造成漏检。血清学诊断对临床病例的确诊没有太大意义，而FQ-PCR检测方法能够在2 h 内对弓形虫病进行诊断，因此PCR 方法是检测猪弓形虫病的最佳方法。

对60 份疑似猪弓形虫感染的临床样品进行FQ-PCR 检测，结果有32 份样品呈阳性，阳性检出率为53.3%，其中全血样品中，15 份为阳性，肺脏组织样品中，17 份为阳性，说明利用PCR 方法对活体猪全血样品和病死猪脏器样品均能进行猪弓形虫病检测。本研究建立的FQ-PCR 检测方法具有高度敏感性，试验证明对整个病猪肺脏组织均能成功检测，说明该方法适于临床检测。

临床出现混合及隐性感染时，病原含量相对较低，采用其他临床检测方法不容易检测到病原，而本研究建立的猪弓形虫FQ-PCR 检测方法最低检出限可达1.0×101拷贝/μL，即使病原含量较低，也可准确检测区分。

4 结论

本研究设计了猪弓形虫特异性引物对和探针，优化筛选了最佳引物探针浓度组合，最终成功建立了猪弓形虫实时荧光PCR 检测方法。本方法特异性好，能高效扩增目的基因，而对其他病原核酸无扩增；敏感性好，最低能检测到1.0×101拷贝/μL。本研究建立的猪弓形虫实时荧光PCR 检测方法是一种简便、快速，特异性和敏感性较高的诊断方法，可用于猪弓形虫的快速检测及鉴别诊断。