一种河北块菌的鉴定和抗氧化活性研究

杨金凤 张 婷 李 洁

（河北民族师范学院 生物与食品科学系，河北 承德 067000）

块菌（Truffles）是一类呈块状的地下真菌的通称，包括真块菌、假块菌和豆块菌[1]63-67三个不同的科属。常生长于钙质的土壤中，多与针叶树和阔叶树植物的根系共生，形成外生菌根[2]。我国的块菌主要分布于云南、四川、新疆和西藏等地，此外在河北、山西、湖南、吉林、甘肃、辽宁、北京、福建、湖北和台湾等地均有少量分布[3]1560-1565。块菌大多数是以宏观特征如子实体和子囊孢子的形态特征来进行区分，但在区分两个形态比较相似或亲缘关系较近的种时会遇到难题[4]6-10，而分子生物学的应用克服了传统形态学观察的缺点，为生物种属的确定提供了可靠的证据。

块菌又被称为“猪拱菌”，其营养丰富，气味芬芳。富含多种氨基酸、蛋白质以及不饱和脂肪酸等生理活性成分及多样性的微量元素，具有抗氧化、抗突变、抑菌、保肝、抗癌和抗炎等广泛的生物活性[5]465-472，且抗氧化能力比其它食用菌高[6]2567-2581。本研究对河北野生白块菌和云南黑块菌抗氧化能力进行初步研究，以期为河北块菌的开发和利用提供一定的理论基础。

1 试验材料

河北白块菌，采自河北省承德市双桥区普宁寺后山；云南黑块菌，采自云南怒江自治州贡山县丙中洛镇。

2 试验方法

2.1 块菌形态观察

2．1．1 外部形态观察

肉眼观察河北白块菌子实体的形状、大小、颜色，子囊果表面有无疣突或被绒毛或微绒毛等结构。

2．1．2 解剖结构观察

横切面观察：菌脉的排列情况、颜色，产孢组织的颜色、质地等；

显微结构观察：采用徒手切片法制成块菌子实体临时装片，观察孢子囊的大小、形状、颜色以及孢子的数目、大小、形状和表面纹饰等。

2.2 块菌分子生物学水平鉴定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取河北白块菌基因组DNA，以通用引物

18S1(CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA)18S2(CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT)进行扩增。扩增体系模板1µL，2×Master Mixture 12.5µL，18S1/18S2引物各1µL，加ddH2O补足至25µL。扩增程序：94℃预变性4 min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35 个循环，72℃平展10 min，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并将产物送至上海生工进行双向测序。

2.3 块菌提取物的制备

参照郭坦等[5，7-9]块菌提取物的制备方法稍作修改。准确称取干燥的块菌菌粉20．000g加入800mL55%的乙醇，浸泡48h后超声提取30min，8000rpm离心5min，取上清液旋蒸至无醇味，加入等体积的石油醚萃取，静置分层，将各层得到的粗提物浓缩，定容至20mL，4℃避光保存，备用。

2.4 块菌提取物抗氧化活性测定

2．4．1 总抗氧化能力的测定

总抗氧化能力的测定参照延莎等[10-13]的方法稍作修改。取0．2mL待测样品加入0．6mL的28mmol/L磷酸钠溶液、4mmol/L钼酸铵溶液和0．6mol/L硫酸溶液，混匀后于95℃水浴90min，以溶剂作为空白对照，冷却后在695nm处测定吸光度值，并以VC标准品测定总抗氧化能力标准曲线，计算块菌提取物相对于VC的浓度。

2．4．2 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参照张婷等[10，14]方法适当修改。取待测样品500µL，加入DPPH自由基溶液6mL，并加入无水乙醇补足至10mL，以溶剂作对照，在517nm下测量各样品吸光度值A样品，计算各样品DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[(A对照-A样品)/A对照]×100%

2．4．3 羟自由基清除能力的测定

羟自由基清除能力的测定参照张新国等[15-18]的方法。取1．0mL各待测提取物，依次加入1．0mL9．0mmol/L硫酸亚铁、1．0mL9．0mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1．0mL8．8mmol/LH2O2，迅速混匀，37℃恒温30min，于510nm波长下测定其吸光度值Ax，以VC作为阳性对照，以溶剂作为空白对照A0；以蒸馏水代替9．0mmol/L的水杨酸-乙醇溶液作为样品对照Ab。计算羟自由基清除率：

羟自由基清除率（%）=[A0-(Ax-Ab)]/A0×100%

3 结果与分析

3.1 生长环境与形态学特征

河北白块菌生长于土壤干燥且通气良好的山坡地，其周围生长有各种草本植物、灌木以及乔木，河北白块菌在土壤下2～30厘米处与植物的根共生（图1）。子囊果地下生，整体形状近似球形，颜色为白黄色至黄褐色，子囊果外覆盖有白色菌丝，表面凹凸不平有内陷的小孔，表面光滑或稍粗糙，无疣突，成熟的块菌表面有龟裂（图2）。

图1 河北白块菌生长环境

图2 块菌外部形态结构

如图3-a所示块菌子实体产孢组织黄褐色，成熟后形成空腔向内凹陷，菌脉白色，呈大理石纹理样，菌脉贯穿整个子囊果。由3-b可以看出产孢细胞呈不规则状散乱分布，子囊在产孢组织内自由排列，3-c、d显示子囊呈球形至椭圆形或圆柱状至棒状，无色透明，每个子囊内包含有8个子囊孢子，子囊孢子呈球状，黄色至黄褐色，孢子表面具有明显的钝刺；显微镜下能明显看到其菌脉纹理结构。

3.2 块菌分子生物学鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增产物大小约为1500 bp（图4）。M为DL2000，1为阴对照，2、3为河北白块菌。

图4 PCR电泳图

将测序结果进行序列拼接后与NCBI数据库中的数据进行比对，与编号为AJ305045．1的地菇状马蒂奥洛块菌18SrDNA区段的DNA序列同源性达100%，两者对比的Max score值为1144，碱基覆盖率达96%。结合形态学特征，确定该河北白块菌属于地菇状马蒂奥洛块菌（Mattirolomyces terfezioides）。

3.3 块菌提取物抗氧化活性分析

3．3．1 总抗氧化能力

按照2．4．1测定总抗氧化能力的方法，绘制VC标准品总抗氧化能力标准曲线，结果如图5。

图5 VC总抗氧化能力标准曲线

测定各层块菌提取物的总抗氧化能力，根据标准曲线方程计算出各层提取物相对于VC标准品的浓度(mg/mL)，结果如表1所示。

表1 块菌提取物总抗氧化能力

由表1可知，河北白块菌水层提取物的总抗氧化活性最强，其次是乙醇层提取物，石油醚层提取物的总抗氧化能力最低。每毫升1g河北白块菌的水层提取物的总抗氧化能力相当于14．4225mg/mL的VC标准品，是云南黑块菌水层提取物总抗氧化能力的2．29倍；河北白块菌乙醇层提取物的总抗氧化能力是云南黑块菌的2．31倍。

3．3．2 DPPH自由基清除能力

将水层提取物稀释10倍，乙醇层和石油醚层提取物均未稀释，测定各层块菌提取物的DPPH自由基清除率，结果如表2所示。含0.1g块菌的提取物；乙醇层和石油醚层提取物未稀释，为每毫升含1g块菌的提取物。

表2 DPPH自由基清除能力

由表2可知，河北白块菌和云南黑块菌提取物都有一定的DPPH自由基清除能力，其中河北白块菌水层提取物的DPPH清除能力最高，达51．90%，显著高于黑块菌水层提取物；石油醚层提取物的最低；河北白块菌乙醇层提取物DPPH清除能力也明显高于云南黑块菌，原因可能是河北白块菌乙醇层提取物中含有较多具有抗氧化活性的物质。

3．3．3 羟自由基清除能力

将水层提取物稀释100倍，乙醇层和石油醚层提取物稀释10倍，测定各层块菌提取物的羟自由清除率，结果如表3所示。

表3 羟自由基清除能力

由表3可知，两种块菌水层提取物的羟自由基清除能力最高，并且河北白块菌水层提取物清除能力明显高于云南黑块菌，与100µg/mLVC标准品清除羟自由基能力相比，河北白块菌水层提取物是其1．49倍，云南黑块菌是其1．13倍；二者乙醇层提取物羟自由基清除能力无显著差异，石油醚层提取物几乎无羟自由基清除能力。

4 结论与讨论

本试验通过对河北白块菌和云南黑块菌三种不同提取物的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力进行研究发现：两种块菌水层提取物的抗氧化活性均为最强，推测可能是水层提取物中含有较多的多糖类等水溶性物质。为了验证这一点，试验中对两种块菌水层提取物多糖含量进行了测定，其中河北白块菌多糖含量为16．54mg/g，云南黑块菌多糖含量为4．28mg/g，初步认为块菌多糖含量与其抗氧化活性之间呈现一定的对应关系，这与前人研究食用菌多糖具有抗氧化功效的结果一致[19-20]。乙醇层提取物和石油醚层提取物抗氧化能力较低可能是溶于乙醇和石油醚的抗氧化物质较少。因此，对于块菌提取物的生物活性成分、含量以及与抗氧化活性之间的关系有待于进一步的研究。本实验只对块菌提取物的抗氧化活性进行了初步的研究，对于提取物的制备条件还有待于进一步的优化。同时可对不同块菌提取物进行体内抗氧化能力研究，以期为其功能开发提供一定的理论依据。