正交法优选柔毛淫羊藿生品炮制工艺研究*

张 敏，李 玮，王先菊，刘娅琴，魏洪利，杜洪志

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶[1]。始载于《神农本草经》，被列为中品，具有祛风除湿、补肾壮阳、增强免疫、保护心血管等功效。主要分布在长江流域。在吉林、辽宁、甘肃、山西、陕西、浙江、安徽、福建、江西、四川、贵州等地均有分布。淫羊藿中有黄酮类、苯酚苷类、木酯素类、多糖类、生物碱类、色酮类等化学成分[2]。淫羊藿苷为淫羊藿的主要活性成分之一，具有增强机体免疫力[3]、延缓衰老[4]、抗病毒、抗肿瘤、改善并保护心脑血管[5]、促进成骨细胞增殖[6]、抗骨质疏松[7]、抗动脉粥样硬化[8]、拟雌性激素[9]等作用。淫羊藿在现今医药领域用处广泛，为贵州省同济堂制药有限公司主打产品“仙灵骨葆胶囊”中主要配方药物之一。该品种药物在2013年销售额就已经达到8.5亿元。

淫羊藿历代炮制方法主要有羊油脂炙、酒炙、米泔水浸制等，现代炮制方法主要为羊油炙，有关淫羊藿饮片炮制中最基本的切制研究甚少，2015版《中国药典》中收载的淫羊藿饮片炮制工艺为：除去杂质，喷淋清水，稍润，切丝，干燥，并未记载具体的工艺参数，不利于企业规范化及大规模化生产。本研究以淫羊藿苷含量为优化切制工艺参数的指标，采用高效液相色谱法测定其含量，设计正交试验以优选出柔毛淫羊藿切制最佳工艺，将其工艺参数具体化。

1 仪器、试剂

1.1 仪器

LC-20AT 230V高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；JA2003型千分之一电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；ME204E型万分之一电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；ZT-150型高速多功能粉碎机(永康市展帆市工贸有限公司)；HS10260D型超声波清洗机(天津恒奥科技发展有限公司)；CS101-1C型鼓风干燥箱(重庆四达实验仪器厂)；SHZ-D III型循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试剂

淫羊藿苷对照品(购自中国食品药品检定研究院，ID：TBJ6-WPU3，批号：11504-20154，经面积归一化处理含量>99%)；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20180113，色谱纯)；无水乙醇(重庆川东化工(集团)有限公司，批号：20180801，分析纯)；甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20180226，色谱纯)；水为娃哈哈纯净水。淫羊藿药材采自贵州省贵阳市修文县龙场镇原庆文厂，经贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为小檗科植物柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim的干燥叶。

2 方法

2.1 炮制方法

2.1.1 单因素试验

为考察炮制过程中浸润时间、浸润水量、切丝宽度、干燥温度等因素对淫羊藿饮片品质的影响，设计以下单因素试验进行考察。

1)浸润时间 取淫羊藿原药材，除去杂质，分4份，每份10 g，加入药重的 1倍水量分别浸润0.5 h、1 h、2 h、3 h，切成2～4 mm宽的丝，在60 ℃下干燥至同等干燥程度，备用。

2)浸润水量 取淫羊藿原药材，除去杂质，分成4份，每份10 g，分别加入药重的0倍(即不加水)、0.5倍、1倍、1.5倍水量浸润0.5 h，切成2～4 mm宽的丝，在60 ℃下干燥至同等干燥程度，备用。

3)切丝宽度 取淫羊藿原药材，除去杂质，分成3份，称重，每份10 g，加入药重的1倍水量浸润0.5 h，分别切成1～2 mm、2～4 mm、4～6 mm宽的丝，分别在60 ℃下干燥至同等干燥程度，备用。

4)干燥温度 取淫羊藿原药材，除去杂质，分成4份，称重，每份10 g，加入药重的1倍水量浸润0.5 h，切成2～4 mm宽的丝，分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下干燥至同等干燥程度，备用。

2.1.2 正交试验

考虑不同单因素之间可能存在相互间的影响，根据单因素考察结果，以L9(34)正交设计优选淫羊藿最佳炮制工艺条件，试验因素及水平见表1。

表1 正交试验L9(34)因素及水平Tab.1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

2.2 淫羊藿苷的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：SN：10375993 Therm色谱柱(Dim.(mm)250×4.6)；流动相：乙腈-水(30∶70)；检测波长：270 nm；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解制得浓度为0.25 mg/mL的淫羊藿苷对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液制备

取淫羊藿样品粉末0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取不同体积“2.2.2”项下制备的对照品储备液，加适量的甲醇溶液制成淫羊藿苷浓度分别为0.25 mg/mL、0.20 mg/mL、0.1875 mg/mL、0.15 mg/mL、0.14 mg/mL、0.125 mg/mL、0.09375 mg/mL，按上述色谱条件测定其含量。

2.2.5 样品测定

取样品粉末，按照“2.2.3”项下制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量。

2.3 最佳工艺验证

为验证优选出的最佳炮制工艺的科学性、稳定性和可重复性，对正交试验优选出的最佳切制工艺进行3批次验证性试验。取柔毛淫羊藿生品3份，每份3个平行样，以最佳炮制工艺条件炮制淫羊藿，测定淫羊藿苷的含量。

3 结果与分析

3.1 线性关系

以峰面积值为纵坐标(Y)，进样浓度为横坐标(X)进行线性回归，得淫羊藿苷的回归方程为：y=2E+07x-140867.90(R2=0.9996)。结果表明淫羊藿苷在0.94～2.5 μg范围线性关系良好。

3.2 单因素分析

3.2.1 浸润时间

在浸润时间分别为0.5 h、1 h、2 h、3 h时，柔毛淫羊藿中淫羊藿苷的质量分数分别为1.90%、1.6%、1.62%、1.21%。方差分析P<0.05，说明差异具有显著意义。当浸润时间为0.5 h时，柔毛淫羊藿中淫羊藿苷的含量最高。随着浸润时间的增大，淫羊藿苷含量呈下降趋势，因此考虑浸润时间为0.5 h。

3.2.2 浸润水量

在浸润水量为0倍、0.5倍、1倍、1.5倍水量的条件下，淫羊藿苷的质量分数分别为1.97%、1.91%、1.85%、1.81%。由方差分析P<0.05，差异具有显著意义，且浸润水量为0倍时，淫羊藿苷含量最高，因此选择0倍水量浸润为宜。

3.2.3 切丝宽度

在切丝宽度为1～2 mm、2～4 mm、4～6 mm的条件下，淫羊藿苷质量分数分别为2.07%、2.01%、2.07%。由方差分析P>0.05，可知切丝宽度对淫羊藿苷含量的影响无显著性差异。结合实际生产综合考虑，以2～4 mm的切丝宽度为宜。

3.2.4 干燥温度

在干燥温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的条件下，淫羊藿苷质量分数分别为1.99%、1.87%、2.20%、1.76%，方差分析P<0.05，差异具有显著性。当干燥温度为60 ℃时，其含量最高，因此考虑干燥温度以60 ℃为宜。

3.3 正交试验结果

由方差分析表(表2)可知，不同的浸润水量相比较具有显著性差异(P<0.05)，浸润时间、干燥温度对淫羊藿质量的影响均无显著性差异(P>0.05)。由直观分析表(表3)可知，各因素对淫羊藿生品影响顺序为：浸润水量>浸润时间>干燥温度。因此，根据方差分析比较及直观分析表均值选取最佳工艺为：A1B1C3，即淫羊藿最佳炮制工艺为：取生淫羊藿，除杂，保持其干燥，切成2～4 mm宽的丝，在70 ℃下稍干。

表2 方差分析表Tab.2 Variance analysis

表3 正交试验直观分析表Tab.3 Orthogonal test results and direct analysis

3.4 最佳工艺验证

取生淫羊藿，除杂，保持其干燥，切成2～4 mm宽的丝，在70 ℃下稍干，以此工艺平行制备3份样品，每个样品3个平行样。按2.2.1节下色谱条件测定，得最佳工艺制备3个平行样的平均含量为2.29%，RSD值均小于3%，说明该工艺合理可行，结果见表4。

表4 最佳工艺验证结果Tab.4 Verification results of the optimal techniques

4 结论与讨论

4.1 结论

以浸润时间、浸润水量、切丝宽度、干燥温度为考察因素进行正交试验设计，以淫羊藿皂苷含量为评价指标，采用正交试验优选淫羊藿生品最佳炮制工艺，得出淫羊藿生品最佳炮制工艺为：取淫羊藿生品，除去杂质，切成2～4 mm宽的丝，在70 ℃下干燥。最佳工艺验证试验表明，该工艺稳定、可行。

4.2 讨论

目前，市面上淫羊藿饮片的用处广，用量较大，但其质量参差不齐。淫羊藿不同采收期、不同产地加工及不同炮制方法对淫羊藿质量的影响较大。本研究以淫羊藿苷含量为质量检测指标，对浸润时间、浸润水量、切丝宽度、干燥温度4个单因素进行考察，结果显示浸润时间、浸润水量、干燥温度对淫羊藿苷含量具有显著性差异，切丝宽度对淫羊藿苷的含量无显著性影响。因此，在设计正交试验时主要对浸润时间、浸润水量、干燥温度进行考察，正交试验结果显示，不同的浸润时间之间具有显著性差异，浸润水量、干燥温度对淫羊藿苷无显著性差异。根据正交试验方差分析与直观分析表中极差及均值大小优选最佳炮制工艺。在该工艺条件下，测得淫羊藿苷的含量为2.29%，大于0.4%，符合药典规定。通过验证性试验结果表明，该工艺稳定、可行，可为淫羊藿生品炮制工艺提供参考。